血清miRNA-195作为帕金森病潜在生物学标记物的初步研究

陈子旋，朱丽娜，刘 雯，解孝艳，杨厉颖，周静雯，徐 将，刘姜冰，王英歌，唐向明

（1.扬州大学医学院，江苏 扬州 225001；2.扬州大学附属医院神经内科，江苏 扬州 225000）

帕金森病（Parkinson's disease,PD）是一种常见于中老年人的神经系统退行性病变，以脑内黑质多巴胺能神经元进行性缺失为病理特征。PD临床运动症状有静止性震颤、运动迟缓、肌强直以及姿势步态障碍等，非运动症状包括认知障碍、嗅觉丧失、便秘等。多数患者的非运动症状较运动症状出现早，PD的诊断主要依赖于临床运动症状。影像学早期无典型特征[1]，缺乏特异性生物学标志物，导致PD早期诊断困难。所以寻找特异性较高的生物学标记物是PD早期诊断的重要问题。为寻找PD早期诊断的生物学标记物，大量学者对脑脊液，血浆，血清，唾液，尿液，皮肤等组织标本进行基因测序，发现血清中循环RNA作为生物学标记物具有优势。尽管大量研究对PD患者血清中miRNA进行探索，结果却存在异质性。Aghili[2]制作出miR-195电化学纳米生物传感器用于早期诊断PD，其敏感性和特异性需进一步证实。本研究旨在探索外周循环血清miR-195与PD发病的相关性，为PD的早期识别提供实验依据。

1 材料与方法

本实验自2018年5月～2019年10月收集扬州大学附属医院72个汉族个体血液，所有受试者均已签署知情同意书。帕金森病的诊断依据典型临床症状和体征以及影像学确诊，主要排除标准包括PD病人合并肿瘤、恶液质、全身或中枢神经系统严重感染；伴有心、肝、肾或其他脏器严重疾病的病史。另收集211个帕金森患者和113个正常体检者的临床资料进行分析。这项研究得到了扬州大学附属医院伦理委员会的批准。

采集空腹安静状态下PD病人和健康者血液，离心取上清液至-80°C贮存。使用miRNA提取分离试剂盒（北京天根）提取小分子RNA。血清中提取出的RNA使用miRcute miRNA cDNA第一链合成试剂进行逆转录。反应液可于-20°C保存。进行下游荧光定量检测前，将cDNA反应液加入4倍DEPC水稀释使用。使用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒（北京天根）、SYBR、miR-195引物和内参U6，配置20ul体系试剂，使用荧光定量聚合酶链反应仪（罗氏LightCycler480）检测。样本一式两份进行，最终miRNA表达量计算为2-ΔΔCt。

2 统计分析

使用统计产品SPSS16.0版进行统计分析，实验中miR-195表达量通过独立t检验，临床数据通过x2检验和独立t检验进行分析。

3 结 果

实验测量和分析了miRNA-195（CT值，7.296±1.42774）的相对表达量。统计学分析发现PD病人血清中miRNA-195（P=0.001）表达量明显高于健康人，结果具有统计学意义。临床收集的211例PD患者中，男性121例，女性90例，年龄处于72.76±8.47岁。临床数据结果由表可知高血压可促进PD进展，糖尿病、吸烟不增加PD的发病风险。PD患者较健康人群外周血红细胞和血红蛋白含量降低。见下表

4 讨 论

目前大部分神经系统疾病的诊断主要依靠临床症状和影像学检查，这使得该类疾病的早期防治策略的开发受到限制。目前已发现多种血清miRNAs可作为PD诊断的生物学标记物。Barbagallo等人[3]对139例神经退行性疾病患者和健康人血清中23种miRNAs检测发现，部分miRNAs的分泌具有特异性，从而可用于神经退行性疾病的无创诊断。本研究测得miR-195在PD患者血清表达上调，与马文斌[4]，曹向阳[5]研究结果一致。Aghili等人[2]制作出miR-195电化学纳米生物传感器用于早期诊断PD，本实验进一步证明其可行性。本研究具有一定的局限性，收集血清样本均来自汉族72位个体，是否适用于其他种族仍需进一步探究，且样本量有待进一步扩大。

本研究发现糖尿病、吸烟与PD发病呈负相关，这与夏虹等人[6]使用meta分析结果一致。脑内胰岛素调节受损与多巴胺转运体基因表达改变具有相关性[7]，这为糖尿病在PD中的不同作用提供了依据。高血压与PD的发生发展密不可分。实验室结果证明PD患者血中红细胞和血红蛋白数量减低。目前有研究提示铁代谢紊乱造成的贫血可作为促进PD病理进展的危险因素，而外周血中高氧化应激状态和红细胞内α-突触核蛋白的聚集可能加重对外周血红细胞的破坏作用[8]。

变量 所有病例（n=324） PD组（n=211） 正常组（n=113） t值或x2值 P值危险因素（n，%）高血压史 116（35.8） 92（43.6） 24（21.1） 16.01 0.000糖尿病史 65（20.1） 35（16.6） 30（26.5） 4.55 0.033高脂血症史 9（2.8） 4（1.9） 5（3.8） 1.74 0.187吸烟史 64（19.8） 24（11.4） 40（35.4） 26.79 0.000饮酒史 16（4.9） 10（4.7） 6（4.5） 0.05 0.821常规实验室检查（images/BZ_10_1975_3056_1995_3090.png±s）白细胞（*109个/L） 6.29±2.46 6.23±2.62 6.59±1.53 0.639 0.524血红蛋白（g/L） 129.04±17.04 126.46±16.20 141.33±15.78 4.107 0.000血小板（*109个/L） 174.72±53.01 174.34±52.72 176.54±55.44 0.184 0.854红细胞（*1012个/L） 4.21±0.59 4.15±0.54 4.48±0.77 2.517 0.013肌酐（mmolL） 79.10±59.29 76.36±59.29 69.08±15.54 -0.594 0.553

miRNA作为PD早期识别生物学标志物的临床意义包括阻碍和延缓症状的发生，前移PD康复治疗的时间窗，帮助病人做到提前干预，在指导康复治疗中起到辅助作用。尽管血清中的一些microRNAs可以作为潜在的帕金森病生物学标记物，但距离应用于临床诊断仍有很大距离。目前临床对早期帕金森病的误诊率高达25%，多在神经元损伤后5～15年内方可确诊，临床更多目光聚焦于帕金森病的康复治疗。目前康复治疗方法多种多样，但均需要针对个别患者特征制定不同的康复计划。运动影像和动作观察疗法、虚拟现实、耐力运动训练、力量训练，有氧训练和物理疗法被认为是有前途的PD康复方法。另外，负责神经功能障碍康复的Lokomat机器人常应用于帕金森疾病康复治疗，使患者运动能力得到改善[9][10][11]。随着科技和医疗的发展，PD的康复治疗将会有更多的进展，这也将为PD患者带来更多有效的治疗方案。

5 结 论

血清miRNA-195可能作为帕金森病诊断的生物学标记物，目前需要更多的研究来证实。吸烟、糖尿病与PD发病呈负相关，高血压、贫血是PD发生的危险因素。帕金森病无法达到治愈目的，临床注重PD患者的康复治疗。