基于NIR高光谱技术快速预测冷鲜鸡肉热杀索丝菌含量

何鸿举,蒋圣启,马汉军,2,王 慧,陈复生,康壮丽,潘润淑,朱明明,赵圣明,王正荣

(1.河南科技学院食品学院,河南新乡 453003; 2.河南科技学院博士后研发基地,河南新乡 453003; 3.河南工业大学粮油食品学院,河南郑州450001)

我国众多肉类食品中,鸡肉占据重要地位,现已成为百姓餐桌上的主要食品之一[1]。因含有多种营养素、肉质细嫩且更易被人体消化吸收,鸡肉逐渐成为我国居民的主要选择之一[2-3]。据统计,目前我国鸡肉消费量占到总禽肉消费量的90%以上,且在未来几年鸡肉的消费量还有逐年增加的趋势[4]。目前市场上流通的鸡肉主要有热鲜肉、冷鲜肉和冷冻肉[5]。随着我国居民生活水平的不断提高,消费者的鸡肉消费理念也在逐渐改变,冷鲜鸡肉因能够最大限度地保持其质地柔软、弹性好、口感鲜美和营养价值,在我国大中城市已成为生鲜肉消费的主流。然而,冷鲜鸡肉在冷藏过程中由于水分含量多、营养物质丰富,容易受到一些嗜冷菌如热死环丝菌、假单胞菌、肠杆菌、乳酸菌、莫拉氏菌和不动杆菌等的污染而引发肉品腐败变质,从而导致其品质下降,是新鲜度降低的最主要原因。热杀索丝菌属于兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌,它在低氧和4 ℃的条件下能较快的生长繁殖,因此是引起冷却肉腐败的主要微生物[6-7]。热杀索丝菌占冷却鸡肉初始菌相的13.3%,在0～4 ℃冷藏温度下导致冷藏鸡肉和鸡肉制品腐败变质的主要腐败菌之一[8-9]。Li等[10]研究发现,热杀索丝菌还是冷却猪肉托盘包装后导致其腐败变质的主要微生物。国外学者Leroi等[11]和Russo等[12]已经将热杀索丝菌的某一特定菌株建立了生长预测模型。国内学者高磊等[13]对冷却鸡肉中热杀索丝菌进行了分离、鉴定并对致腐能力进行了评价。刘超群等[14]建立并且验证了冷鲜猪肉中热杀索丝菌生长动力预测模型,判定系数R2的值达到了0.99 以上。及时准确检测热杀索丝菌,有针对性地对其加以控制,可促进肉品新鲜度,对延长货架期具有直接意义。目前,热杀索丝菌检测常用的方法有平板计数法,分子生物学法,免疫学法等,尽管这些方法结果可靠,但都存在操作繁琐、需要破坏原材料、检测时间长、效率低下、难实现批量检测等缺点。随着冷鲜肉消费量的不断增加,以及消费者对新鲜肉品的强烈需求,迫切需要研发新技术以实现对冷鲜鸡肉热杀索丝菌的快速无损检测。

高光谱成像技术(Hyperspectral imaging,HSI)作为一种新兴的无损检测技术,近年来在食品品质方面的研究备受关注。与传统的光谱技术相比,HSI技术具有高分辨率,其光谱精度可达2～3 nm,不仅能反应样品光谱信息的细微变化,还可提供更多与试验样品相关的信息[15]。目前,HSI技术在鸡肉微生物方面的研究已有报道,如Feng和Ye等[16-17]分别采用HSI快速预测新鲜鸡肉的总细菌含量(TVC),经光谱数据分析,可得鸡肉TVC的预测相关系数分别为0.96和0.83;Feng等[18]采用近红外HSI对鸡肉中的肠杆菌科进行了研究,其所得鸡肉肠杆菌科预测模型的相关系数为0.93,其结果较好。然而,作为冷鲜鸡肉储藏过程中的主要腐败菌之一的热杀索丝菌[19-20],目前采用近红外高光谱技术对其在鸡肉中检测的相关报道较少,故本实验以冷鲜鸡肉为研究对象并基于高光谱成像技术的快速优势,通过挖掘光谱数据和冷鲜鸡肉中热杀索丝菌之间的内在相关性,构建一种快速定量检测热杀索丝菌的方法,为改善甚至将来代替常规检测手段提供数据支撑和方法借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

冷鲜鸡胸肉 河南众品食业股份有限公司;CM881热杀索丝菌培养基 英国Oxoid公司;CM0509缓冲蛋白胨水 英国Oxoid公司;80% NaCl溶液 实验室现配;无菌蒸馏水 实验室自制;超纯水 实验室自制。

HSI-eNIR-XC130型推扫式高光谱成像系统 台湾五铃光电科技有限公司;The Unscrambler 9.7建模软件 挪威CAMO公司;Matlab程序开发软件包 美国Mathworks公司;20040081型Haier冰箱 中国海尔公司;SW-CJ-1D双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司;DHP-9902恒温培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;KQ-100DB型数控超声波清洗器 江苏昆山市超声仪器有限公司;VORTEX-6振荡器 江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司;WT5003CH型玻璃罩精密天平 常州万泰天平仪器有限公司;Ultra class UV plus超纯水仪 德国SG公司;HV-85全自动高压灭菌锅 日本Hirayama公司;BF240微生物培养箱 德国Binder公司;Scientz-04拍打式均质机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的预处理 由河南众品食业股份有限公司提供的新鲜的鸡胸肉(长度(16±1.5) cm,宽度(11±1.5) cm)置于冷藏箱内运至食品学院肉品实验室,剔除表面肌膜并将整块鸡胸肉分割成3.0 cm×3.0 cm×1.0 cm(长×宽×高)的小块(约10 g),共获得127块样品;将样品分装7份至一次性带盖的塑料盒内并贴上标签,置于4 ℃的冰箱内,分别储藏1、2、3、4、5、6、7 d,每天取出若干样本,进行光谱数据的采集及样品中热杀索丝菌含量的测定。

1.2.2 高光谱数据采集 光谱数据采集之前,需从4 ℃冰箱内取若干待测样品,并将其置于室温下待其恢复至室温,同时将高光谱成像系统的光源提前打开进行预热,待其稳定后方可对参数进行设置,即曝光时间为4.65 ms,扫描速度为6.54 mm/s时仪器状态最佳。具体高光谱设置参数方法参考王慧等[21]研究。为降低相机暗电流和室内照明对样品图像采集过程中所带来的影响,需对原始图像进行黑白校正,故先采集黑白板的图像后,方可对样品进行扫描试验,其检测波长范围为900～1699 nm。按如下公式进行校正[21]:

式(1)

式中,R-校正后的图像;R0-原始高光谱图像;RB-黑板图像,其反射率为0%;RW-白板图像,其反射率为99.9%。

1.2.3 热杀索丝菌的检测 高光谱图像采集完毕后,立即测定肉样中的热杀索丝菌菌落总数。利用平板培养法测定[22],具体操作为:将每个10 g样品置于无菌袋中,加入90 mL蛋白胨缓冲液(0.1%蛋白胨+0.85% NaCl),使用拍打式均质机将样品与缓冲液混合均匀,获得热杀索丝菌悬液,然后梯度稀释,依次取1 mL菌悬液加入9 mL蛋白胨缓冲液。最后取0.1 mL菌悬液涂在热杀索丝菌培养基平板上,然后将平板倒置,于25 ℃下培养48 h后,取出,选择菌落数在30～300个之间的平板,取其对数值(lg CFU/g)计数。本研究中记录的标准数据为每g冷鲜鸡胸肉中所含的热杀索丝菌。

1.2.4 光谱提取及预处理 高光谱成像系统在光谱信息采集的过程中会受到仪器自身噪声以及外界环境的影响,因此获取的光谱数据信息中既含有样本本身的信息,同时还包含一些无关样本的噪声信息等。这些无关信息的存在会对模型构建产生很大的影响。因此,需要对原始光谱数据进行预处理,以减少外界环境以及系统噪声的影响,从而获取高性价比的光谱数据,以提高预测模型的精度和稳健性。本试验主要使用多元散射校正(Multiplicative Scatter Correction,MSC)、基线校正(Baseline Correction,BC)和标准正态变量校正(Standard Normal Variable Correction,SNV)三种方法对原始光谱数据进行预处理。其中,MSC法是对每一条光谱的散射进行校正,以获取较理想的光谱信息[23-24];BC法可以明显抑制基线漂移的现象,并改善信号质量[25];SNV法的基本原理是将每条光谱的波长点反射吸光度值看作正态分布,并将原始光谱吸光度值减去该光谱平均吸光度值,最后除去该光谱吸光度值的标准偏差[26-27]。

1.2.5 模型的构建及评价 偏最小二乘(Partial Least Squares,PLS)算法是由伍德和阿巴诺等在1983年首次提出的一种新型多元数据分析方法,它是通过最小化误差的平方和找到一组数据的最佳函数匹配,用最简的方法求得一些绝对不可知的真值,而令误差平方之和为最小。本试验中将热杀索丝菌参考值作为因变量,将全波段的波长作为自变量,通过PLS回归算法来构建预测冷鲜鸡肉中热杀索丝菌含量的PLS预测模型。

PLS模型效果评价使用相关系数(R)、校正误差(Root Mean Square Error of Calibration,RMSEC)、内部交叉验证均方根误差(Root Mean Square Error of Cross Validation,RMSECV)和外部预测均方根误差(Root Mean Square Error of Prediction,RMSEP)等指标[28]。其中用R与1的接近程度来表示模型的精度,用RMSEC、RMSECV、RMSEP与0的接近程度来反映模型的稳定性[29]。

1.2.6 最优波长的选择与模型优化 本试验中获得的全波段光谱在900～1699 nm波长范围内,其中包含485个波长,若采用这485个波长作为建模的输入变量,则存在大量的冗余信息,需采用合适方法选取最优波长,剔除无用信息以减少数据计算量,从而提高模型的构建效率和精度。本试验采用PLS-β系数法和逐步回归法(Stepwise)筛选最优波长。PLS-β法是在高光谱领域应用最为广泛的一种特征波长提取方法,来源于PLS建模过程[30]。Stepwise是多元线性回归法中选择特征波长的一种常用数学方法,即利用逐步回归法按一定显著水平筛选出统计检验显著的波长。续投影算法(Successive Projections Algorithm,SPA)是一种逐步循环的变量选择方法,可以将有效的信息从大量的光谱数据中筛选出来,找到光谱变量之间共线性最小的特征波长,优化建模条件[31]。将获取的特征波长作为输入变量,进行全波段PLS回归模型(F-PLS)优化,建立最优波长PLS模型。此外,当输入变量个数小于样本个数时,还可使用多元线性回归(Multiple Linear Regression,MLR)法建立预测建模[32]。将经PLS-β、Stepwise和SPA三种方法所提取的特征波长优化F-PLS模型,并比较所建预测模型的精度和性能。

1.3 数据处理

PLS-β法在软件Unscrambler 9.7中进行,Stepwise和SPA操作在MATLAB2016a中进行,而模型构建使用化学计量学软件Unscrambler 9.7完成。

2 结果与分析

2.1 热杀索丝菌含量

实验样品的热杀索丝菌的测量结果如表1所示。将所有样品的测量值依照从小到大排序,按每四个样品中随机取一个样品(1/4)选入预测集,剩余样品(3/4)选入校正集。

表1 鸡肉热杀索丝菌测量值的统计结果Table 1 Statistical results of Brochothrix thermosphacta values in chicken

2.2 鸡肉样品光谱特征

使用HSI-eNIR-XC130型推扫式高光谱成像系统自带软件HSI Analyzer软件进行高光谱图像校正和光谱信息提取。利用HSI Analyzer软件选取感兴趣区(Region of interest,ROI),感兴趣区域的大小为3 cm×3 cm,像素为640×417。然后求得感兴趣区域内所有像素点的平均光谱数据。为了综合反映每块样品整体信息从而减小误差,将样本的平均光谱曲线作为光谱曲线。最终得到127 样品×485波长的原始平均光谱数据集合。然后进行三种预处理,127个样品原始光谱特征及三种预处理平均光谱特征如图1所示。

图1 冷鲜鸡肉的近红外光谱特征Fig.1 NIR spectroscopic characteristics of the fresh chicken samples注:a:原始光谱,b:MSC光谱,c:BC光谱,d:SNV光谱。

从图1可得,不管是原始光谱还是预处理光谱,不同样品的光谱曲线总体趋势一致,但每个样本的光谱曲线有高低之分,这是由于鸡肉品样本的化学成分含量不同导致的,近红外光谱出现吸收峰是源于鸡肉中化学组分中的各种含氢基团(包括O-H、N-H、C-H等)发生伸缩、弯曲等运动的合频吸收[33]。虽然光谱上没有明显的热杀索丝菌吸收峰,但是热杀索丝菌的生长离不开鸡肉中的各种化学组分,可以通过化学计量学手段挖掘光谱信息,寻找到特征光谱信息与热杀索丝菌之间的定量关系。

2.3 基于全波段光谱的F-PLS模型预测热杀索丝菌

本实验基于三种不同预处理全波段485个波长,采用PLS回归算法来挖掘鸡肉热杀索丝菌的含量与光谱信息之间的相关性。结果如表2所示。

表2 鸡肉热杀索丝菌F-PLS回归预测结果Table 2 F-PLS performance for predicting Brochothrix thermosphacta values in chicken

由表2得知,用预处理光谱构建的3种F-PLS回归模型预测冷鲜鸡肉热杀索丝菌的效果良好,相关系数相近(RC、RCV和RP),均接近于1.0,误差也较小(RMSEC、RMSECV和RMSEP)。其中,经BC预处理的F-PLS模型相关系数(RC=0.984、RCV=0.960、RP=0.973)均高于其他两种预处理,且误差(RMSEC=0.208 lg CFU/g、RMSECV=0.330 lg CFU/g、RMSEP=0.295 lg CFU/g)均低于其他两种预处理,故BC预处理的光谱所构建的热杀索丝菌的F-PLS回归模型的性能和稳定性最优。此外,对比三种不同预处理F-PLS模型的校正集RMSEC与验证集RMSEP绝对值差ΔE可知,BC预处理的光谱所构建的热杀索丝菌的F-PLS回归模型的ΔE最小,为0.087 lg CFU/g,这说明了在三种预处理的光谱所构建的PLS回归模型中,BC预处理的光谱所构建的F-PLS模型具有最好的鲁棒性。故以下数据的进一步处理均采用BC预处理的光谱进行操作。

2.4 最优波长提取

采用PLS-β法、Stepwise和SPA算法从BC预处理全波段光谱中筛选出最优波长,以减少数据运算量、提高建模效率,本试验使用The Unscrambler 9.7和MATLAB 2016a两个软件对最优波长进行提取,其提取结果如表3所示:

表3 特征波长提取结果Table 3 Results of optimal wavelengths selected from BC spectra

由表3得知,通过PLS-β、Stepwise和SPA三种方法筛选出特征波长的个数均不同,且都在40个以下。波长减少量都达到了90%以上。PLS-β、Stepwise和SPA三种方法筛选出最优波长的个数分别为25、32个和27个。其中PLS-β法所提取的波长数最少,相比较于全波段485个波长,波长减少量最高,达到了94.8%。PLS-β筛选出 25个特征波长分别为900.6、905.5、908.8、930.2、933.5、951.6、1017.4、1025.7、1086.5、1124.4、1167.1、1183.6、1213.2、1265.9、1336.6、1364.6、1376.2、1389.4、1405.8、1428.9、1499.9、1523.0、1673.5、1688.5和1695.1 nm,具体位置如图2 所示。

图2 BC预处理光谱中系数法筛选出的最优波长具体位置Fig.2 Specific location of the optimal wavelengths selected by PLS-β from the BC pretreatment spectra

2.5 基于最优波长的F-PLS模型优化

基于PLS-β、Stepwise和SPA分别筛选出的特征波长作为输入变量,热杀索丝菌参考值为因变量重新运算,优化F-PLS回归模型和建立MLR预测模型,结果如表4所示。

由表4可得,表4中所建立的6种鸡肉热杀索丝菌的预测模型的相关系数R值均高于0.8,且均方根误差均较小。其中通过PLS-β和Stepwise筛选出的最优波长所构建的PLS-β-PLS、PLS-β-MLR、S-PLS和S-MLR四种预测模型相关系数R值均高于0.89。而基于SPA法筛选的最优波长所建的SPA-PLS 和SPA-MLR预测模型的相关系数均小于0.9。综合考虑最优波长个数和模型相关系数以及鲁棒性。其中基于PLS-β法筛选的最优波长所建PLS-β-PLS模型的波长数量最少(25个),RP最高且RMSEP最低,RMSEC与RMSEP 绝对值差次最小,此模型的运算效率、预测性能和稳定性均优于其他5种模型。最优模型预测结果如图3所示。

3 结论

采用近红外(900～1699) nm高光谱成像技术对不同冷藏时期鸡胸热杀索丝菌含量进行快速无损检测研究。基于三种不同预处理光谱信息(MSC、SNV、BC),构建全波段F-PLS模型来预测鸡肉热杀索丝菌含量,均取得了较好的效果。其中采用PLS-β法和Stepwise算法来筛选特征波长分别建立优化的PLS和MLR模型,结果显示基于PLS-β法中筛选的25个特征波长构建的PLS-β-PLS模型预测效果较好。故近红外高光谱成像技术结合PLS-β法建立预测模型可潜在实现对鸡肉热杀索丝菌含量的快速预测。此外,本研究仍有不足之处,下一步工作将增加建模样本数量,扩大检测范围,进一步提高模型的精度和稳定性。同时,也将在鸡肉中热杀索丝菌的可视化分布方面进行深入研究。