多粮和桑葚固液分离发酵保健酒的开发研究

周晓龙，张金修，刘新利

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）生物基材料与绿色造纸国家重点实验室，山东济南 250353；2.齐鲁工业大学（山东省科学院）山东省微生物工程重点实验室，山东济南 250353；3.山东金氏红高粱酒业公司，山东济南 250353）

中国传统工艺酿制的白酒因酒精度过高、营养成分少等原因被新一代消费者质疑，他们逐渐倾向柔和低度、营养的饮品，对酒类产品的营养价值诉求越来越强烈[1]；研究表明，桑葚果酒对人体健康有益[2]，但果酒的风味和低酒精度，不具有白酒诸香协调、酒体醇厚绵柔的特点而受冷落；因此，如何让白酒既能保留独特风格又能满足人们对健康的需求。我们开发了桑葚发酵酒和蒸馏酒混合饮品，取名桑葚红高粱印象酒。

桑葚在我国种植面积十分广泛，含有较丰富的维生素、矿物质、氨基酸等，是一种具有代表性的高营养水果。但在自然环境下，桑葚保质期很短，具有不耐贮运、易受破损和杂菌污染等特点，桑葚如果短期没有及时销售或进行深加工，会给果农造成巨大的经济损失，同时也严重影响桑葚的利用价值。鲜桑葚中含有多糖、游离酸、粗纤维、蛋白质、维生素、氨基酸等[3-5]。经过发酵的桑葚果酒具有较高的花青素含量，其抗氧化活性随着发酵的进行逐渐增大[6]。白藜芦醇是桑葚中最主要的活性物质，是抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗心脑血管疾病的化学预防剂[7-9]，具有抗菌、护肝肾及免疫调节作用[10-11]，能有效地清除各类自由基,抑制脂质过氧化反应[12-13]。关于提取的白藜芦醇有许多研究，而我国也已经将白藜芦醇提取物应用于美容、减肥的天然保健品中[14-15]。

综合这些因素，本文研发出一种固液发酵结合的桑葚加高粱白酒保健酒，合理利用桑葚中的活性物质，为研发符合现代健康理念的蒸馏酒提供一定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原材料：佳木斯生产的优质红高粱，越南产晚季糯米，夏津金黄小米、桑葚、小麦，中温大曲和红米曲。

酒样：桑葚果酿造酒、白酒1 是按照图1 中发酵工艺酿制而成的白酒，白酒2 是市售某品牌的相近工艺同等次的清香型白酒。

试剂：无水乙醇、甲醇、乙腈（均为色谱纯）、乙酸、盐酸（≥36 %）、苯酚、氮气（纯度99.9 %）、柠檬酸钠、氢氧化钠、白藜芦醇标准品（纯度≥96%）、乙酸乙酯、乳酸乙酯和己酸乙酯标准品。以上试剂均购买自国药集团化学试剂有限公司。

仪器设备：L-20AT 高效液相色谱High Performance Liquid Chromatography，岛津制作所；L-8900Basic 氨基酸分析仪,日本东京日立高科技科技公司；GC-IMS 气相-离子迁移谱G.A.S Flavour-Spec®Ion Migration Spectrum，济南海能仪器股份有限公司；5840R 高速冷冻离心机High speed homogenizera，艾本德中国有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白藜芦醇的测定

白藜芦醇的标品制备：准确称取白藜芦醇标准品5 mg，使用甲醇溶液溶解并定容至10 mL，即为500 mg/L 的单标储备液，然后将标准液梯度稀释至0.5 mg/L、1 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、7.5 mg/L的标准使用液，做白藜芦醇的标准曲线。酒样中白藜芦醇的测定见参考文献[16]植物源性食品中白藜芦醇和白藜芦醇苷的测定：NY/T2641—2014。

样品制备：称取20 g 酒样于100 mL 离心管，加入10 mL 无水乙醇混匀，于4000 r/min 离心10 min，将上清液转入50 mL 的容量瓶中，样品残渣用10 mL无水乙醇提取2次后合并提取液，无水乙醇定容至50 mL，摇匀过0.45µm 滤膜待测。

1.2.2 氨基酸的测定

标准溶液的制备：分别称取单个氨基酸标准样品于同一烧杯中，用8.3 mL 的6 mol/L 盐酸溶液溶解，精准转移至250 mL 容量瓶中，用水稀释定容至刻度，制成氨基酸标准储备液；准确吸取氨基酸标准储备液1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，加pH2.2 柠檬酸钠缓冲液定容至刻度，混匀为标准上机液。

样品的制备：将桑葚果酒、桑葚保健酒、白酒1号和白酒2 号通过茚三酮粗测，过0.45 µm 滤膜后取500µL 放入液相进样小瓶中待测。游离氨基酸的测定见参考文献[17]。

1.2.3 四大酯类物质的测定

本文主要对白酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯四大酯类测定，其方法见参考文献[18]。

1.3 气相离子迁移谱（Gas-ion mobility spectrometry）分析

检测方法：取1 mL 酒样，加9 mL 水稀释，装入20 mL 顶空进样瓶中，80 ℃孵化10 min，经顶空进样用气相离子迁移谱仪FlavourSpec®进行测试。分析条件参数见表1、表2、表3。

表1 气相-离子迁移谱单元分析条件参数

表2 自动顶空进样条件参数

表3 气相色谱条件

1.4 原料选取和工艺流程

1.4.1 原料分析

选用蛋白质偏高的原料，可增加酒中多元醇、α-联酮类物质和芳香族物质的含量；糯米总淀粉含量76.98 %，其中支链淀粉含量高达76.42 %，支链淀粉能更好的锁住水分，固态发酵淋浆少，酿出的酒体具有绵长、软甜特点；桑葚经检测鲜果含糖量21%，含18 种氨基酸，氨基酸总量为7.188%；小麦中含有阿魏酸，在微生物的作用下生成香草醛、香草酯、4-乙基愈创木酚。采用中温大曲、红米曲等多曲共同双边发酵，可加强糖化发酵能力和酯化能力，提高出酒率和蒸馏酒的品质。通过表4 实验证明，选取5%的桑葚添加量为宜。工艺采用混曲双边发酵，将中温大曲和红米曲混合，可以提高糖化力和酯化力，释放出更多风味物质，发酵蒸馏阶段再次将原料中养生因子溶入酒中，提高蒸馏酒的营养价值。

表4 桑葚添加量和工艺参数对出酒率的影响

1.4.2 工艺流程

工艺流程图见图1 和图2。

2 结果与分析

2.1 白藜芦醇含量分析

实验通过高效液相色谱HPLC（High Performance Liquid Chromatography）测定标品，建立标准曲线后检测酒样中白藜芦醇含量。白藜芦醇的标准曲线见图3，含量对比见表5。

表5 酒样中白藜芦醇的含量对比

根据表5 数据，桑葚保健酒营养价值明显优于白酒1 和白酒2，这也是果粮结合发酵的一个创新点，桑葚保健酒中白藜芦醇含量比一般保健食品中的含量要高，柴菊华等[19]研究不同葡萄品种酿制的葡萄酒中白藜芦醇含量最高约为8.04 mg/L；闫仲丽等[20]测定果浆保健品中白藜芦醇含量约为2.93 mg/L，同样低于桑葚保健酒中白藜芦醇含量。

保健酒中的白藜芦醇主要来源于单独发酵的桑葚果酒中，将发酵好的果酒和蒸馏酒混合之后，白藜芦醇在自然条件下分别以自由态和糖苷两种顺反异构体存在，自由态易溶于醇、酮类物质，在液态发酵过程中随着醇、酮类含量的增加有益于白藜芦醇的浸提；另一方面异构体白藜芦醇糖苷在发酵过程中酶的诱导作用下释放大量的白藜芦醇，提高桑葚活性物质的利用率，赋予蒸馏酒更高的保健价值。

2.2 保健酒中酯类和游离氨基酸分析

酯类是赋予酒体香味的芳香族物质，酒中的酯含量及比例决定其香型和质量。本实验通过高效液相色谱HPLC(High Performance Liquid Chromatography)分析检测了酒样中的四大酯类含量（见表6）。

表6 结果显示，桑葚保健酒中乙酸乙酯、乳酸乙酯含量高于白酒1 号和白酒2 号，生成的乙酸乙酯含量也优于霍权恭[21]报道的5 种不同香型白酒的含量，4 种酯比例独特（乙酸乙酯＞乳酸乙酯＞己酸乙酯＞丁酸乙酯），符合清香型白酒风格，从而形成了清爽甘洌、香味协调的独特风格[22]。四大酯类的含量变化对酒的风格有着决定性的影响，乙酸乙酯含量高时呈苹果和香蕉香，低时呈梨和菠萝香；己酸乙酯浓时呈辛辣和臭味，其含量不能过高；乳酸乙酯赋予酒体醇厚带甜的口感；丁酸乙酯浓时呈不愉快的脂肪臭味，稀时有朗姆酒的香味。总体而言，桑葚保健酒的乙酸乙酯和乳酸乙酯含量高，丁酸乙酯和己酸乙酯含量低，酯香协调。

氨基酸主要来源于原料中蛋白质的酶解,发酵过程中微生物的代谢产物和微生物细胞自溶[23-24]，酒中氨基酸对白酒的口味有一定影响[25]。分析酒中游离氨基酸可为揭示酒发酵、蒸馏和贮存过程中含氮化合物的变化提供依据。张庄英等[26]研究发现，成品酒游离氨基酸总量13.66～34.01 mg/L，桑葚保健酒中总游离氨基酸含量为31.2 mg/L，均高于白酒1 号和白酒2 号，加入桑葚之后氨基酸种类明显增加，丰富白酒的口感和调节人体氨平衡。游离氨基酸含量的测定见表7。

表6 3种样品中四大酯类物质的含量对比

表7 酒样中游离氨基酸含量的测定 (mg/L)

2.3 桑葚保健酒中挥发性风味物质

白酒香气丰富度取决于发酵过程中产生的挥发性代谢物，杨亮等[27]检测到酱香型、浓香型白酒中挥发性物质分别为60 种、35 种；邓莉[28]采用顶空固相微萃取-气质联用的方法共鉴定出33 种风味化合物；牛云蔚等[29]在3 种五粮液酒中共鉴定出30种香气物质。

利用气相-离子迁移谱定性分析桑葚保健酒中的挥发性风味物质，定性出47 种风味物质，其中23 种酯类物质，8 种酮类物质，7 种醇类物质等，白酒1 号检测出43 种，白酒2 号检测出35 种；桑葚保健酒中的酯、酮和醇类都多于白酒1 号和白酒2号，其中醛类物质种类较少，表明该酒比较柔和，与上述文献报道相比，风味物质种类丰富。表8 是桑葚保健酒风味物质种类对比。

2.4 气相-离子迁移谱分析酒样中物质差异性

利用气相-离子迁移谱对不同酒样进行分析，可以比较不同白酒和果酒之间的风味差异性。图4 是果酒和白酒之间的差异性对比。

从图4 可以比较4 种酒之间的风味物质差异性，本实验开发的桑葚蒸馏酒从图4 可以看出，其挥发性物质最为丰富，明显优于桑葚果酒，与某品牌高档白酒1 号和中档白酒2 相比风味物质也有一定的优势，推断桑葚干果与多粮食结合发酵的工艺具有可行性，通过验证这种桑葚保健酒的风味明显优于其他酒，既有粮食发酵白酒的风味物质，同时也有桑葚发酵酒赋予的果香和清香，还有美丽的色泽及保健因子。表明果粮结合的发酵酒和蒸馏酒到达了研发的预期目标。

从图5 可以看出不同酒样的差异，首先，桑葚果酒样品中挥发性有机成分明显少于其他3 种酒样中的挥发性成分；其次，桑葚保健酒样品中的挥发性成分要比其他两个（白酒1 号和白酒2 号）样品中的挥发性有机成分多。其中1 号框中选出的挥发性有机物分别是桑葚保健酒、白酒1 号和白酒2 号酒样中特有的，桑葚果酒中不存在；而4 号框选出的挥发性有机物则是桑葚果酒中特有的，白酒中则不存在；3 号框中的挥发性有机物则是桑葚保健酒和2 号白酒所含有的，而在2 号白酒中含量很少或者没有；2 号框中的挥发性有机物则是桑葚保健酒和白酒2 号共有的；综上比较得出桑葚保健酒的挥发性风味物质最多，酒的香气成分最为丰富。

表8 3种不同酒样的挥发性物质分析

3 结论

本文研究采用多粮与桑葚干果为原料，根据粮食固态发酵增香，桑葚果液态发酵酒除杂的原理，采取独特的固液分离技术，利用中温大曲和红米曲混合发酵糖化剂，将所得两种原酒精心勾兑，长期贮存、自然老熟后包装成产品。该产品入口绵甜，味道醇美，且果香明显，色泽艳丽，具有独特的风格，应属创新型品种。

通过这种工艺酿制的桑葚保健酒中白藜芦醇含量高于葡萄酒和一些桑葚保健品中的含量，酯类物质也比其他香型白酒的种类多，风味物质丰富，工艺具有可行性，表明这种新型的果粮结合发酵酒和蒸馏酒结合的生产探索是具有社会效益和经济效益的。