CD47对正常妊娠不同阶段绒毛STOX1表达的影响*

王 颢 谭玉杰

郑州大学附属洛阳中心医院，河南省洛阳市 471009

CD47是免疫球蛋白超家族的一员，普遍存在于人类细胞膜表面。人们发现信号调节蛋白α可识别并结合巨噬细胞表面跨膜CD47糖蛋白，参与调节免疫识别、细胞黏附、应激反应及细胞存活等途径，是诱导免疫耐受的重要调节分子[1]。因此在流产保胎治疗靶点干预研究上该因子逐渐成为探索的重点，但目前具体机制尚不明确。STOX1基因定位于人类10号染色体长臂2区2带1亚带上，是该染色体上的特有的基因开放阅读框。在子痫前期的研究中发现其为与该病有密切关联的印迹基因，并认识到绒毛滋养细胞上的STOX1基因可通过干预绒毛侵袭，对胎盘的生长发育起很重要影响[2]。

目前人们在CD47对STOX1干预及二者与绒毛发育的相关性认识上尚不明确。因此本研究拟通过开展对CD47干预不同阶段绒毛STOX1的表达并观察此两者与绒毛的发育的相关性，初步了解它们在滋养细胞的增殖、分化和凋亡过程中的相互影响，为流产保胎的靶向免疫治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 标本资料

1.1.1 实验组：选择2017年3月—2019年5月在我院妇产科就诊的因非意愿妊娠要求人工流产的健康妇女，将其分为早孕1组(妊娠5～7+6周，30例)，早孕2组(妊娠8～11周，30例)。

1.1.2 选择标准：两组年龄设定20～40岁。所选病例均为胎儿发育正常，并经染色体核型分析鉴定。同时排除妊娠合并症和并发症。

1.2 方法及观察指标

1.2.1 绒毛细胞培养和染色体鉴别：人流吸宫术获取无菌绒毛组织，取大约20mg绒毛，生理盐水反复清洗，拉碎后加入由0.25%胰蛋白酶充分消化，离心(2 000r/min，10min)去上清，收集细胞均匀接种，加入绒毛细胞培养液，于CO2培养箱中培养5d后利用倒置显微镜观察细胞生长情况，当传代细胞形成小克隆后即可收获细胞进行G显带制片分析绒毛染色体。

1.2.2 细胞传代培养并转染CD47：倒置显微镜观察培养瓶瓶壁细胞铺满约90%即可传代。弃旧液，加入0.25%胰蛋白酶消化后，倒掉消化液，加入新培养液，反复吹打，每瓶细胞传三瓶继续培养。将携带CD47基因的慢病毒质粒和空质粒转染各组绒毛细胞。然后用蛋白免疫印迹法检测慢病毒CD47基因细胞株中蛋白的表达量，以验证转染效率。

1.2.3 细胞凋亡检测(流式细胞法)：提前1d将CD47干预前后各组绒毛细胞置入6孔板中，CO2培养箱中培养1d后，胰酶消化，收集细胞，PBS冲洗，离心(1 000r/min，5min)，收集细胞沉淀。加入缓冲液悬浮细胞，加入5μl Annexin V-FITc混匀后，避光室温孵育15min，加入5μl PI标记，流式细胞仪分析各组绒毛细胞的凋亡率。

1.2.4 RT-qPCR检测STOX1 mRNA的表达：提取各组的绒毛细胞总RNA，逆转录得到特异性cDNA，目的片段长度195bp。随即行real time PCR试验。计算STOX1mRNA相对表达量。

2 结果

收获的绒毛细胞行G显带分析染色体核型分析提示均为正常健康人类染色体，未见明显数目和结构异常，其中32例46，XY；28例46，XX。绒毛细胞凋亡率随着孕周增加逐渐降低，且经CD47干预的绒毛细胞较未转染时凋亡率明显降低(P<0.05)，详见表1。STOX1 mRNA的相对表达量在各组绒毛组织间存在差异(P<0.05)，未干预前早孕1组表达相对较低，随着孕周进展早孕2组表达相应增高。CD47干预后各组STOX1 mRNA表达仍呈现为随着孕周的增加而上升，且相对干预前各对应组明显升高(P<0.05)，详见表2。

表1 CD47干预前后各组绒毛细胞凋亡率比较

表2 CD47干预前后各组 STOX1 mRNA表达情况比较

3 讨论

流产的病因复杂，严重危害育龄妇女生殖健康，其发病机制及治疗是目前妇产科领域研究的重点与难点。对流产机制中母体免疫耐受与细胞凋亡调控方面的探索近几年有突飞猛进的发展[3-4]。

人们认识到恶性肿瘤细胞表面CD47表达异常增高，当它与巨噬细胞表面的信号调节蛋白α识别后通过磷酸化途径激发，大大降低巨噬细胞杀伤清理异常细胞的功能，形成免疫耐受，其与肿瘤的侵袭、转移和预后密切相关[1，5]。在探索白血病发病机制的研究中发现白血病干细胞表面的CD47在激发细胞的增殖分化方面起积极的作用，并且其能明显抑制细胞凋亡速度。在子宫内膜癌的发生发展的研究中同样发现这个机制的存在[6]。

绒毛合体滋养细胞和细胞滋养细胞中表面同样存在STOX1，它可以激活α-T-连环蛋白的过表达，进而破坏绒毛外滋养细胞侵袭能力[7]。人们认识到当细胞有丝分裂的启动子细胞周期蛋白B1与STOX1结合识别后，可明显正反馈激发增殖细胞核抗原、细胞周期相关蛋白的过表达，从而加速细胞分裂速度，诱发细胞增殖分化[8]。目前人们在CD47对STOX1干预及二者与绒毛发育的相关性认识上尚不明确。

在本项研究中，笔者以孕早期正常染色体的绒毛作为研究对象，发现绒毛细胞凋亡率随着孕周增加相应降低。在CD47转染的绒毛细胞中其凋亡率明显更低。说明绒毛细胞随着孕周增加其稳定性增加。在抑制细胞凋亡和促进细胞增殖上CD47起着积极作用，能显著加固绒毛的稳定性。

滋养细胞的顺利形成到胎盘良好发育对妊娠成功至关重要，有研究发现STOX1通过调控细胞周期对绒毛和胎盘的发生、发展过程起着积极参与作用[9-11]。本次研究发现在随着孕周增加绒毛中STOX1 mRNA表达也有相应增高趋势。CD47干预后的绒毛细胞中STOX1 mRNA表达相对未干预各对应组明显升高。提示STOX1的表达受CD47因子正反馈影响，并对绒毛细胞的增殖、侵袭及抗凋亡起积极作用。从二者的相关性笔者推断STOX1 是CD47下游调节因子，CD47通过正向干预滋养细胞上STOX1的表达，能有效地抑制细胞凋亡，促进滋养细胞的增殖和侵袭。

综上所述，绒毛组织中CD47高表达可正反馈上调STOX1的表达，并随着孕周进展干预效果也越明显。CD47及STOX1可能通过调控滋养细胞的凋亡参与绒毛的发生、发展进程，对妊娠的成功维持起着重要的作用。本次研究对流产靶向免疫治疗做了初步探索，关于它们如何参与流产的具体分子通路及调控机制，还需进一步研究阐明。