气相色谱-质谱法分析酒花对葡萄酒香气成分的影响

段丽丽，姜良珍，何莲，田怡，王淑雅，杨晓仪，易宇文

（1.四川旅游学院食品学院，四川成都610100；2.成都大学药学与生物工程学院，四川成都610100；3.四川旅游学院烹饪科学四川省高等学校重点实验室，四川成都610100）

酒花，又称忽布（hop）、啤酒花，一种草本蔓性植物，具有镇定和抗菌的效用，是啤酒酿造流程中非常重要的原料之一[1-3]。酒花中含有酒花树脂、酒花油以及多酚等物质，带给啤酒清爽苦味、芬芳香味，有利于啤酒的防腐以及增强啤酒的稳定性。不同品种的酒花，能够赋予酒不同的芬芳香气和独特的苦味[4-6]。法格酒花是英国培育的一种苦香兼优，且含有较多石竹烯和法尼烯，具有木本和草本植物的香气。

风味化学中，常用的气味分析检测技术有气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、气相色谱-闻嗅法（gas chromatographyolfactometry，GC-O）、电子鼻 （electronic nose，ENOSE），3种分析检测技术各有所长。GC-MS能够定性定量确定样品中的具体风味物质[7]，GC-O能够确定样品中具体风味物质的气味[8]；E-NOSE能够短时间迅速分析判别气味之间的差异[9]。在实际研究工作中，GCMS是常用的一种经典分析测试仪器，历史悠久，在众多领域应用广泛，如食品[10-15]、环境[16-18]、农业[19-21]等。

随着时代的变化，我国传统葡萄酒的风味已不能满足消费者的需求[7]，开发不同风味的葡萄酒势在必行。酒花中含有多种风味物质能，能够赋予啤酒丰富的风味。而将酒花引入葡萄酒酿造，目前未见相关报道。为满足消费对葡萄酒的需求和丰富葡萄酒的产品线，结合啤酒花酿造新风味的葡萄酒是我国葡萄酒发展的新趋势。试验拟以不同浓度的法格酒花添加到葡萄酒酿造中产生的风味物质为研究对象，以GC-MS为工具，结合主成分和感官评价等方法，探究其对葡萄酒风味的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酒花（法格）：市售；玫瑰香葡萄：成都金满堂农业开发有限公司；壳聚糖（粒度120目）：深圳天扬生物科技有限公司；酿酒酵母：成都金满堂农业开发有限公司选育；白砂糖：上海市糖业烟酒（集团）有限公司。

PC-420D专用磁力加热搅拌装置；75 μm CAR/PDMS手动萃取头：美国Supelco公司；SQ680气相色谱质谱联用仪：美国PerkinElmer；FALLC4N电子天平：常州市衡正电子仪器有限公司；WK2102电磁炉：美的集团有限公司；MY-50粉碎机：广州市扬鹰医疗器械有限公司；HHS-8S电子恒温不锈钢水浴锅：上海广地仪器设备有限公司。

1.2 酒花葡萄酒酿造的工艺流程

1.3 酒花葡萄酒酿造的工艺要点

1.3.1 酒花溶液制作

首先配置5种浓度梯度0.0 g/L（C00，即按市售葡萄酒的方法制备）、0.5 g/L（E01）、0.8 g/L（E02）、1.0 g/L（E03）和1.3 g/L（E04）的法格酒花溶液。取200 mL蒸馏水加热至100℃，保持2 min，然后加入酒花溶液，熬制4 min，待酒花溶液充分冷却后，再进行过滤，备用。

1.3.2 葡萄酒的酿造

原料预处理：选择成熟、新鲜、无腐烂的玫瑰香葡萄，去除异物，清洗干净，然后去皮取果肉及葡萄籽。

主发酵：将果肉和果肉重量20%的酒花溶液同时放入发酵瓶中，接入1.0%活化后的酵母溶液，调整水浴锅的温度（20℃～25℃）。当出现皮渣下沉，整罐酒体变浑浊，酒液基本没有甜味时，则发酵结束，时间一般为6 d～8 d[22]。前期为控制样品的酒精度，应该按照要求调整加糖量，使得样品的总糖度为22°。

后发酵：主发酵完成后，将漂浮在葡萄酒上方的杂质过滤除去后继续发酵（15℃、120 h）。

澄清：后发酵过程结束后，（2±2）℃低温保藏168 h左右（168 h为一星期，本试验以一星期为一个周期，低温下盐结晶析出，过滤去除），有利于酵母的沉降。采用壳聚糖絮凝澄清法，壳聚糖用量为酒液量的0.05%，时间为10 h，温度为15℃。

陈酿：澄清后获得的酒液在5℃条件下进行陈酿，后放置于阴凉通风环境下进行保藏。

1.4 GC-MS条件

量取葡萄酒4 mL置于15 mL装有磁力搅拌器的顶空瓶中，加入1.0 g NaCl，加盖密封，放入40℃水浴中平衡10 min，将老化好的固相微萃取器插在样品瓶上，吸附40 min后拔出，插入气相色谱仪进样口，于230℃解吸3 min，进行GC-MS检测分析。

1.4.1 气相色谱条件

色谱柱为 DB-Wax（30 mm × 0.25 mm × 0.25 μm）；进样口温度为230℃；升温程序：初始温度40℃，保持5 min，以 6℃/min升至230℃，保持 6 min；载气为氦气，流速0.97 mL/min，不分流。

1.4.2 质谱条件

电离方式为电子电离（electron ionization，EI）源，电子能量为70 eV，灯丝流量为0.20 mA，离子源温度为230℃，接口温度为250℃，扫描范围30.00～500.00 s/z。

1.5 感官评价

评价人员由10名食品专业的在校本科生组成。感官评价小组成员依据GB/T 16291.1-2012《感官分析选拔、培训与管理评价员一般导则第1部分：优选评价员》和GB/T16291.2-2010《感官分析选拔、培训和管理评价员一般导则第2部分：专家评价员》进行人员的选拔、培训与维护。对评价人员依据GB/T 29605-2013《感官分析食品感官质量控制导则》要求进行培训，分别对气味和颜色两个维度进行训练；每个样品重复评价3次。评价标准见表1。

1.6 数据处理

GC-MS试验数据由Xcalibur软件处理，未知化合物经计算机检索同时与NIST谱库和Wiley谱库相匹配，只有当正反匹配度均大于80（最大值为100）的鉴定结果才予以确认。按峰面积归一化法计算各组分的相对含量。主成分、聚类分析及作图均采用origin9.0完成。

表1 不同酒花葡萄酒感官评价标准表Table 1 Sensory evaluation standards of different hops wine

2 结果与讨论

2.1 添加不同浓度酒花的玫瑰香葡萄酒的香气成分GC-MS分析

利用 DB-Wax（30 mm × 0.25 mm × 0.25 μm）毛细管柱色谱分离结合质谱检测，不同浓度酒花酿造的玫瑰香葡萄酒挥发性成分得到的5个样品的离子流图，见图1。

图1 添加不同浓度酒花酿造的玫瑰香葡萄酒的香气成分的气质色谱总离子流程图Fig.1 Total ion flow chart of aromatic components in rose-flavoured grape wine brewed with different concentrations of hops

由图 1 可知，C00、E01、E02、E03、E04 分别分离出有效挥发性物质 17、17、19、20、15 种，E04 的样品挥发性成分相对较少；样品出峰时间主要集中在20 min～30 min之间。

添加不同浓度的法格酒花酿造的玫瑰香葡萄酒中的风味物质成分表，见表2。

表2 添加不同浓度的法格酒花后玫瑰香葡萄酒中的风味物质成分表Table 2 Table of flavor components in rose-flavored grape wine with different concentrations of Fuggle hops

续表2 添加不同浓度的法格酒花后玫瑰香葡萄酒中的风味物质成分表Continue table 2 Table of flavor components in rose-flavored grape wine with different concentrations of Fuggle hops

由表2可知，GC-MS在添加了不同浓度酒花的玫瑰香葡萄酒中共鉴定出33种挥发性成分。在酒花浓度E03的样品中检测到挥发性物质最多，为20种。其次是E02，为19种；空白样和E01的样品，均为17种；添加E04的样品检测到的风味物质最少，为15种。5个梯度样品的挥发性物质相对百分含量分别为68.08%（空白），46.11%（E01），59.47%（E02），83.18%（E03）和 70%（E04）。

酯类物质是葡萄酒中最重要的呈香物质，其特征香味为水果和花香，它是在酿造过程中醇类和酸类的酯化反应生成[23]。5种不同梯度的酒花玫瑰葡萄酒中酯类物质相对百分含量由高到低分别是E03（21.95%），E02（16.44%），E04（11.94%），E01（7.22%），最低为C00（5.56%）。共有酯类物质3种，乙酯类物质是酯类中的主要物质，乙酸酯是由细胞内乙酰转移酶催化的高级醇与乙酰辅酶A缩合形成[24]。检测到的酯类物质种类由多到少分别是 E03（11种），E02（10种），E04（7种），最低为E01和C00（6种）。添加酒花的葡萄酒中酯类物质种类大多高于对照组。这说明添加酒花后，葡萄酒中的酯类物质无论是含量还是种类均有提高，这对葡萄酒的香味提升有促进作用。

醇类物质是酵母在发酵过程中代谢次级产物[25]，它是糖代谢氨基酸脱梭、脱氢产生，是酒中主要呈香物质之一[26]。5种不同梯度的酒花玫瑰葡萄酒中醇类物质相对百分含量由高到低分别是E03（58.75%），E04（58.02%），C00（57.28%），E02（42.52%），最低为E01（8.96%）。添加酒花的玫瑰葡萄酒醇类物质并无明显提高，而且添加量低于E03的样品反而大幅降低，需要进一步研究其原因。检测到的醇类物质种类由多到少分别是 E01和 E02（8种），E03和 C00（7种），E04和（6种）。说明添加酒花对葡萄酒在发酵过程中醇类物质种类并没有明显的影响。1-戊醇、芳樟醇、苯乙醇、α-松油醇、香茅醇是5种梯度酒花葡萄酒的共有成分，5种共有成分在酒花添加量为E03，E04和C00（空白）中较高，在添加量E02较低，在添加量为E01时最低。

酸类物质是葡萄酒发酵过程中的副产物[27]，少部分来源于葡萄自身代谢的其他化合物[28]。酸类物质的含量对葡萄酒口感有重要影响，过多或者过少都会造成不良影响。5种不同梯度的酒花葡萄酒中仅E01的样品中检出一种含量很高的酸类物质–乳酸，而其他样品均未检出，需要进一步研究其原因。

其他类物质共检出5种，且5种不同梯度的酒花葡萄酒均无共有成分。醛类物质2种，酮、醚、烯类物质各一种。

分析5个样品，发现空白对照组与其他样品的差异主要体现在酯类物质。而酯类物质是葡萄酒非常重要的呈香物质。因此可以推测，添加法格酒花会促进葡萄酒在陈酿过程中呈香物质的产生。

2.2 添加不同梯度酒花玫瑰葡萄酒挥发性的主成分分析

为了更加直观反应5种不同梯度的酒花对玫瑰葡萄酒香味物质的影响，对检出的各挥发性物质进行主成分分析，结果见表3、图2。

表3 主成分的特征值及贡献率Table 3 Characteristic value and contribution rate of principal components

图2 添加不同浓度酒花玫瑰葡萄酒挥发性成分主成分分析载荷图Fig.2 The PCA loading diagram of volatile components in rose-flavored grape wine with different concentrations of hops

由表3可知，2个主成分的累积方差贡献率为98.29%，完全能够反应样品的主要信息。王琼等[29]认为前两个主成分超过85%即可反应样品的主要信息。

图2a是添加不同梯度酒花玫瑰葡萄酒挥发性成分的主成分载荷图，图2b是重叠部分放大图。

图中各个挥发性成分在二维图中的位置代表了其对主成分的贡献。越靠近X轴正向表示对第一主成分的贡献呈正相关，越靠近X轴负向表示对第一主成分的贡献呈负相关。靠近Y轴表示的意义与X轴相似。图中，A4（丙酸丁酯）、A5（丙酸异戊酯）、A10（正己酸乙酯）、15（癸酸乙酯）、A16（醋酸乙烯酯）、A18（1-戊醇）与PC1呈正相关。A2（碳酸甲乙酯）、A3（丙酸正丙酯）、A6（丁酸乙酯）、A7（2-甲基丁酸乙酯）、A8（乙酸异戊酯）、A9（醋酸乙烯酯）、A11（丁二酸二乙酯）、A12（苯甲酸乙酯）、A13（辛酸乙酯）、A14（乙酸苯乙酯）、A19（（2R，3R）-（-）-2，3-丁二醇）、A20（正己醇）、22（芳樟醇）、A23（苯乙醇）、A24（α-松油醇）、A25（香茅醇）、A26（橙花醇）、A27（2，3-己二醇）、A28（L-乳酸）、A29（4-羟基-2-丁酮）、A30（二乙二醇丁醚）、A31（苯甲醛）与PC1呈负相关。A21（正庚醇）与PC2呈正相关。A1（乙酸戊酯）、A17（异丁醇）、A32（丙烯醛）与PC2呈负相关方。

图3是添加不同酒花玫瑰葡萄酒挥发性化合物种类主成分图。

图3 添加不同酒花的玫瑰葡萄酒挥发性化合物种类含量主成分分析Fig.3 The PCA of volatile components in rose-flavored grape wine with different concentrations of hops

PC1和PC2分别为58.44%和32.72%，累积贡献率为91.16%，能够反应样品的主要风味轮廓。图中可以看出E03与E04、E02比较相似，它们与C00有一定相似度，与E01差异较大。张晓敏等[30]认为PC1越大，说明PC1的贡献越大，反映在二维图中，两个样品即使在横坐标（X轴）的距离很小，其差异也很大；而两个样品在二维图中即使在纵坐标（Y轴）上距离很大，其差异也很小。图中无法判断E03与E04、E02、C00之间的两两相似度，需要进一步研究。

2.3 添加不同酒花的玫瑰葡萄酒挥发性化合物种类含量聚类分析

图4是不同酒花的玫瑰葡萄酒挥发性化合物种类含量聚类分析结果。

图4 添加不同酒花的玫瑰葡萄酒挥发性化合物种类含量聚类分析Fig.4 The cluster analysis of volatile components in rose-flavored grape wine with different concentrations of hops

图4中C00和E04在8.927 04处聚类，说明其最为相似。E03与C00和E04在13.604 28处聚类，说明这3个样相似度高。E02与E03、C00、E04在17.536 1处聚类，说明这4个样品有一定相似度，且明确了4个样品两两之间的相似度，这是图3主成分分析没能解决的问题。聚类分析对于样品之间的相似度较主成分分析能够更加清晰。5个样品在54.972 94处聚成大类，这能够说明样品E01与其他4个样品差异明显。

2.4 感官分析

图5是添加不同酒花梯度的玫瑰葡萄酒感官评价结果。

图5 添加不同酒花梯度的玫瑰葡萄酒感官评价Fig.5 Sensory evaluation of rose-flavored grape wine with different hop gradients

图中，E03样品的酒香和香气丰满程度较C00和其他样品高，这说明添加E03号样品在气味上要比C00和其他剂量的样品好，这可能与产生更多的风味物质有关。气味得分最低的是E01。E02号样品是色泽得分最高的样品，得分最低是E04号样品。这说明酒花的添加量为E02时，酿造的葡萄酒色泽最佳，而添加量E04时色泽较差，这可能与酒花浓度有关。

3 结论

试验将酿造啤酒的酒花引入到葡萄酒酿造中，通过GC-MS分析不同酒花添加量的葡萄酒挥发性物质，并结合感官评价分析不同酒花添加量对香味和色泽的影响。试验结果表明：GC-MS共检测到33种挥发物质，其中酯类16种，占总比的48.48%，共有酯类物质3种（乙酸异戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯）；醇类11种，占总比的33.33%，共有醇类物质5种（1-戊醇、芳樟醇、苯乙醇、α-松油醇、香茅醇），且E03号样品检测到的共有物质含量最高；酸类物质1种，占总比的3.03%；其他化合物5种，占总比的15.15%。主成分和聚类分析表明C00和E04最为相似，E03与C00和E04相似度高，E02与 E03、C00、E04有一定相似度，E01与其他4个样品差异较大。感官分析表明E03的风味最好，E02的色泽最佳。当添加到玫瑰葡萄酒酿造中的酒花浓度达到一定剂量时，对葡萄酒的风味和色泽有积极的作用，反之则可能是消极作用。本试验为研发新型葡萄酒提供理论依据，为推动我国葡萄酒行业的发展，具有重要的现实意义。