黄豆醋浸过程中成分及其抗氧化性的变化研究

孙 瑶， 樊伟康， 李国央， 杨世浩， 任晓莉

(太原工业学院环境与安全工程系，山西 太原 030008)

黄豆，中国各地均有栽培，亦广泛栽培于世界各地，是重要的农产品之一。黄豆营养全面，富含有大量的不饱和脂肪酸，多种微量元素、维生素及优质蛋白质，其营养及保健功效深受关注。山西老陈醋选用优质五谷经蒸、酵、熏、淋、晒酿就而成，素有天下第一醋的盛誉。食用以醋浸泡的食物对高血压、冠心病、糖尿病、肥胖症、感冒等有辅助疗效，并有延缓人体衰老的作用。醋豆以整粒黄豆作为原料，经食醋浸渍而成，它集合了黄豆和食醋的营养和保健作用。陈继承等[1]研究醋豆液加工过程中主要成分转化及其抗氧化活性变化的结果表明，醋豆液中β-葡萄糖苷酶活性随浸泡温度上升而下降，随浸泡时间和比例增加而升高，在一定浸泡时间内(30 d)，蛋白质含量增加2.21倍，总酸下降27.75%，还原糖增加10.97倍，多酚上升8.37%，DPPH自由基清除率上升1.26倍，半数自由基清除率(IC50)下降78.23%，总抗氧化能力上升1.88倍。Madgi等[2]将刀豆浸泡过夜，也发现单宁含量有所提高。但关于黄豆在醋浸过程中营养成分及其生物活性变化的相关信息较为缺乏，本实验旨在发现不同食醋浸泡的黄豆的蛋白质、多酚含量及其抗氧化性变化规律并进一步研究醋浸时间对主要成分含量和抗氧化性的影响，最后分别进行相关分析，为醋浸黄豆食品的功效性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜黄豆；东湖陈醋，山西老陈醋集团有限公司，总酸：3.5 g/100 mL；东湖白醋，山西老陈醋集团有限公司，总酸：3.5 g/100 mL；考马斯亮蓝G-250；牛血清蛋白，生工上海有限公司；福林酚试剂、Na2CO3、FeSO4、水杨酸、H202、NaNO2、对氨基苯磺酸、N-1-奈乙二胺盐酸盐、磷酸、铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)等。

1.2 仪器与设备

台式高速冷冻离心机TGL18M，湖南凯达科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计JH752，上海菁华科技仪器有限公司；电子天平FA2104B，上海越平科学仪器有限公司；恒温水浴锅HH-3A，金坛市城西腾辉实验仪器厂；磁力搅拌器78-1，常州国华电器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 黄豆的预处理

在室温下，称取等量的新鲜黄豆分别浸泡在1 000 mL的陈醋、白醋中，取未浸泡的黄豆20粒并在浸泡1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31 d后各取样20粒，取出的样品用研钵粉碎后放置在烧杯中，加入适量石油醚进行脱脂过夜，脱脂完成后回收石油醚，将样品抽滤烘干成脱脂豆粉并密封置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 可溶性蛋白的提取及含量测定

称取0.2 g脱脂豆粉放入烧杯中并加入5 mL、50 mmol/L、pH=7.8的Tris-HCl缓冲液，低温搅拌提取30 min，然后放入5 mL离心管中于8 000 r/min、4 ℃离心15 min，用移液枪吸取上清液放入烧杯中混合均匀即为可溶性蛋白的提取液。可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法[3]测定，吸取100 μL提取液放入比色管，以加100 μL、50 mmol/L、pH=7.8的Tris-HCl缓冲液为空白对照，然后加入5 mL考马斯亮蓝试剂，混匀静置20 min后，用紫外分光光度计在595 nm处测量其吸光度值。

1.3.3 多肽的提取及含量测定

称取0.2 g脱脂豆粉放入烧杯并加入5 mL、0.1 mol/L、pH=8.8的Tris-HCl缓冲液，低温搅拌提取1 h，然后放入5 mL离心管中于5 000 r/min、4 ℃离心15 min,用移液枪吸取1 mL上清液放入烧杯中并加入1 mL 12%三氯乙酸，静置30 min后放入5 mL离心管中于10 000 r/min、4 ℃离心15 min，用移液枪吸取上清液放入烧杯中混合均匀后即为多肽的提取液[4-5]。多肽含量采用考马斯亮蓝法测定，吸取100 μL上清液放入比色管，以加100 μL、0.1 mol/L、pH=8.8的Tris-HCl缓冲液为空白对照，然后加入5 mL考马斯亮蓝试剂，混匀静置20 min后，用紫外分光光度计在595 nm处测量其吸光度。

1.3.4 多酚的提取及含量测定

称取0.1 g脱脂豆粉放入烧杯中，然后加入2.5 mL无水乙醇，在低温避光密封的条件下提取2 h，然后放入5 mL离心管中于4 000 r/min、20 ℃离心15 min，用移液枪吸取上清液放入烧杯中混合均匀即为多酚的提取液[6]。多酚含量采用福林-肖卡法[7]测定，吸取200 μL提取液放入比色管中加1 800 μL蒸馏水，以加200 μL无水乙醇的比色管为空白对照，加入100 μL福林酚试剂混匀后静置8 min在分别向比色管中加入300 μL Na2CO3溶液(l20 g/L)，放入30 ℃水浴锅中避光水浴30 min，取出后用紫外分光光度计在760 nm处测量其吸光度。

1.3.5 羟基自由基清除能力的测定[8]

目前，临床上尚无特效药物用于治疗面部激素依赖性皮炎。常规西药或外用综合治疗该病可达到百分之八十以上，但治疗结束后复发风险较高，临床治愈率也较低。激素依赖性皮炎是随着现代医学的发展而发生的皮肤病。糖皮质激素具有抗炎，免疫抑制和抗过敏等作用，对皮肤病有一定治疗作用，但若选择不当和药物滥用，可引起激素依赖性皮炎的发生，出现脸部灼热和瘙痒，甚至影响美观，对患者社交、生活和工作均产生不良影响，需要给予有效治疗[3]。

在1 mL磷酸缓冲液(0.2 mol/L，pH=7.4)中加入 0.5 mL H2O 、0.5 mL 邻二氮菲试剂(1.865 mmol/L)、0.5 mL FeSO4试剂(1.865 mmol/L)、0.5 mL样品或0.5 mL H2O2(0.03%，体积分数)，混匀，放置5 min后用紫外分光光度计在510 nm处测定吸光度。按式(1)计算羟基自由基清除率。

(1)

式中：As为加入待测液的吸光度值；Ab为不加待测液与氧化剂的对照值；An为不加待测液的对照值。

1.3.6 DPPH自由基清除率的测定[9]

称取20 mg DPPH溶于250 mL无水乙醇中制得DPPH溶液。取0.5 mL样品加无水乙醇将样品稀释至4 mL，取一组比色管A1分别向管中加2 mL样品和2 mL DPPH溶液，另取一组比色管A2分别向管中加2 mL样品和2 mL无水乙醇，再取一个比色管A0向管中加2 mL无水乙醇和2 mL DPPH溶液，以无水乙醇作参比，混匀后静置30 min，放入分光光度计中于503 nm处测吸光度，清除率可式(2)计算：

(2)

式中：A1为DPPH溶液与样品反应后的吸光度；A2为样品与无水乙醇本身的吸光度；A0为DPPH溶液未与样品反应的吸光度。

1.3.7 ABTS自由基清除率的测定[10]

取ABTS储备液(7.4 mmol/L)和K2S2O8试剂(2.6 mmol/L)各1 mL混合，室温避光条件下静置12 h～16 h，然后用无水乙醇稀释至其A734 nm=0.7±0.02，制得ABTS工作液。取ABTS工作液3 mL，分别加入150 μL的样品或乙醇，振荡10 s，静置6 min，用紫外分光光度计在734 nm处测定吸光度。按式(3)计算ABTS自由基清除率。

(3)

1.3.8 总黄酮含量的测定

以芦丁为标准品，用80%的甲醇配制成1 mg/mL的标准液，用紫外可见分光光度计在200 nm～360 nm处进行光谱扫描，得到芦丁标准品的最大吸收波长。然后取稀释的样品，在芦丁的最大吸收波长处测吸光度，根据芦丁标准曲线得到总黄酮含量。

2 结果与讨论

2.1 黄豆醋浸过程中可溶性蛋白含量的变化

用白醋和陈醋浸泡的黄豆中可溶性蛋白含量的变化如第3页图1和图2所示。在白醋和陈醋中，随着浸泡时间的延长，黄豆中可溶性蛋白含量明显地降低。在浸泡1 d后白醋豆的可溶性蛋白的含量就降低到3.08 μg/mL，下降了76.4%；陈醋豆的可溶性蛋白含量降低到5.41 μg/mL，下降了58.7%。此后，随着时间的延长，可溶性蛋白的含量出现了起伏变化，但是总体趋势降低。可溶性蛋白浓度降低可能是由于大多数可溶性蛋白会降解成为小分子进入到醋液中，可溶性蛋白含量的升高可能是由于其中的部分蛋白复合物经过较长时间(白醋27 d，陈醋23 d～27 d)的浸泡之后发生了降解，释放出一部分可溶性蛋白产物造成了可溶性蛋白含量升高，之后又被降解成小分子进入醋液中而使可溶性蛋白含量下降。

图1 白醋浸泡过程中黄豆可溶性蛋白含量的变化

图2 陈醋浸泡过程中黄豆可溶性蛋白含量的变化

2.2 黄豆醋浸过程中多肽含量的变化

用白醋和陈醋浸泡的黄豆中多肽质量浓度的变化如图3和图4所示。在白醋和陈醋中，随着浸泡时间的延长，黄豆中多肽含量总体呈上升趋势。在浸泡1 d后白醋豆的多肽质量浓度就升高到1.77 μg/mL；陈醋豆的多肽质量浓度升高到2.48 μg/mL。此后，随着时间的延长，多肽的含量出现了较大的起伏变化。多肽浓度升高可能是由于大多数可溶性蛋白会降解成为多肽，多肽含量的下降可能是由于其中的多肽被降解成小分子进入醋液中而使多肽含量下降。

图3 白醋浸泡过程中黄豆多肽质量浓度的变化

图4 陈醋浸泡过程中黄豆多肽质量浓度的变化

2.3 黄豆在醋浸过程中多酚含量的变化

用白醋和陈醋浸泡的黄豆中多酚含量的变化如图5和图6所示。在白醋和陈醋中，随着浸泡时间的延长，黄豆中多酚含量总体呈先下降后上升趋势。在浸泡1 d后白醋豆的多酚的质量浓度就下降到32.48 μg/mL；陈醋豆的多酚质量浓度下降到30.70 μg/mL，与对照相比多酚含量下降了近50%。此后，随着时间的延长，白醋和陈醋浸泡的黄豆中多酚含量的变化出现了差别。白醋豆中多酚含量总体呈现一种平稳的状态，而陈醋豆中多酚含量呈现明显的上升趋势，在第31天多酚质量浓度达到最大，为68.64 μg/mL。

图5 白醋浸泡过程中黄豆多酚质量浓度的变化

图6 陈醋浸泡过程中黄豆多酚质量浓度的变化

多酚质量浓度的降低可能是由于大多数可溶性蛋白会降解成为多酚，多酚含量的下降可能是由于其中的多酚溶于醋液中而使多酚含量降低。另一方面，较长时间的醋浸会有助于黄豆中不溶性酚类物质的溶出，同时醋中的某些多酚类成分也会渗透到黄豆中，导致醋豆中多酚含量增加，并且由于白醋和陈醋酿造原料和方法不同，其中所含多酚类物质的含量不同，这也导致了醋豆中多酚含量的变化差异，但这有待于进一步的研究。

2.4 黄豆在醋浸过程中总黄酮含量的变化

用白醋和陈醋浸泡的黄豆中总黄酮含量的变化如图7和图8所示。在白醋和陈醋中，随着浸泡时间的延长，黄豆中总黄酮含量变化趋势有所不同。在浸泡1 d后白醋中黄豆的总黄酮的质量浓度就下降到0.51 mg/mL；陈醋中黄豆的总黄酮质量浓度下降到0.48 mg/mL，与对照相比总黄酮质量浓度分别下降了31.4%和35.7%。此后，随着时间的延长，白醋和陈醋浸泡的黄豆中总黄酮质量浓度的变化出现了差别。白醋中黄豆的总黄酮质量浓度总体呈现一种平稳的状态，在第11天达到最大值。而陈醋中黄豆的总黄酮质量浓度呈现明显的上升趋势但趋于平稳，在第19天总黄酮质量浓度达到最大。总黄酮质量浓度的降低可能是由于部分黄酮类物质被醋酸降解。另一方面，较长时间的醋浸会使醋中的某些总黄酮类成分渗透到黄豆中，导致醋豆中总黄酮质量浓度增加，并且由于白醋和陈醋酿造原料和方法不同，其中所含总黄酮类物质的含量不同，这也导致了醋豆中总黄酮含量的变化差异，这还需进一步验证。

图7 白醋浸泡过程中黄豆总黄酮质量浓度的变化

图8 陈醋浸泡过程中黄豆总黄酮质量浓度的变化

2.5 黄豆在醋浸过程中抗氧化性的变化

2.5.1 羟基自由基清除能力的测定结果

用白醋和陈醋浸泡的不同醋浸时间的样品，取相同体积且多酚质量浓度均为30 μg/mL时羟基自由基清除率的变化如图9和图10所示。在浸泡的第一天，无论是白醋还是陈醋浸泡的黄豆中所提取的多酚的羟基自由基清除率最大，分别为58.38%和63.11%。随着浸泡时间的延长，多酚提取物的羟基自由基清除率逐渐下降。白醋豆中多酚的羟基自由基清除率为逐步下降趋势；陈醋豆第5天至第23天的样品中多酚的羟基自由基清除率维持了一个比较稳定的水平。推测在浸泡早期，部分物质被醋酸降解形成了具有较强的羟基自由基清除率的多酚物质，而较长时间的醋浸会使多酚类物质组成或结构上发生进一步的改变，导致样品多酚提取物的羟基自由基清除率下降。

图9 白醋浸泡过程中黄豆羟基自由基清除率的变化

图10 陈醋浸泡过程中黄豆羟基自由基清除率的变化

2.5.2 DPPH自由基清除能力的测定结果

用白醋和陈醋浸泡的不同醋浸时间的样品，取相同体积且多酚质量浓度均为30 μg/mL时DPPH自由基清除率的变化如第5页图11和图12所示。随着浸泡时间的延长，不同浸泡时间样品的多酚提取物的DPPH自由基清除率逐渐增大。白醋豆中多酚的DPPH自由基清除率从第9天起达到一个相对稳定的水平；陈醋豆样品中多酚的DPPH自由基清除率逐渐上升。推测较长时间的醋浸会使多酚类物质组成或结构上的改变，产生了DPPH自由基清除率较强的成分。

图11 白醋浸泡过程中黄豆DPPH自由基清除率的变化

图12 陈醋浸泡过程中黄豆DPPH自由基清除率的变化

2.5.3 ABTS自由基清除能力的测定结果

用白醋和陈醋浸泡的不同醋浸时间的样品取相同体积且多酚质量浓度均为30 μg/mL时ABTS自由基清除率的变化如图13和图14所示。随着浸泡时间的延长，不同浸泡时间样品的多酚提取物的ABTS自由基清除率逐渐增大。白醋豆中多酚提取物的ABTS自由基清除率逐渐上升，第29天样品的多酚提取物的ABTS自由基清除率最高，为10.49%。陈醋豆样品中多酚的ABTS自由基清除率从第1天起维持一个相对稳定的水平，第19天样品的多酚提取物ABTS自由基清除率最高，为7.24%。从总体来看，白醋中黄豆的多酚提取物与陈醋中黄豆相比其ABTS自由基清除率更高一些，但是与相同浓度下的DPPH自由基清除率相比则整体偏低。

图14 陈醋浸泡过程中黄豆ABTS自由基清除率的变化

3 结论

本实验研究了黄豆在东湖陈醋和东湖白醋浸渍过程中可溶性蛋白质、多肽、多酚含量及其抗氧化性的变化。黄豆在醋浸过程中，可溶性蛋白质含量显著降低，多肽含量总体呈增长趋势。陈醋中黄豆的多酚含量及总黄酮含量随浸泡时间逐步增大，且高于白醋中黄豆提取物。抗氧化活性方面，随着浸泡时间增加，样品相同浓度的多酚提取物羟基自由基清除率下降，而DPPH、ABTS自由基的清除能力呈上升趋势。陈醋中黄豆多酚提取物的DPPH自由基清除率高于白醋中黄豆多酚提取物，而其他两个抗氧化性指标则相差不大。总之，采用陈醋浸泡黄豆在多酚及总黄酮含量及DPPH自由基清除率方面都优于白醋，因此在醋豆食品加工当中建议采用陈醋。