RP-HPLC法测定甘氨酸原料药有关物质研究

赵士敏 许 岗 施细文 王 敏

（湖南福来格生物技术有限公司，湖南 长沙 410000）

甘氨酸（Glycine，缩写Gly）又名氨基乙酸，甘氨酸是内源性抗氧化剂还原性谷胱甘肽的组成氨基酸，机体发生严重应激时常用外源补充，有时也称为半必需氨基酸[1]。甘氨酸在食品、医药等领域应用广泛[2]。在医药行业中可以用作氨基酸制剂、抗胃酸冲剂以及其他赋形剂[3]。甘氨酸的工业生产方法主要有3 种，天然蛋白质水解法、氯乙酸氨解法和Strecker 法。目前国内普遍采用氯乙酸氨解法，国外则以Strecker 法为主。甘氨酸的原料药中可能会产生甘氨酸酐、亚氨基二乙酸、2-氯乙酸、双甘氨肽、三甘氨肽等杂质，但是国内尚未有关于测定甘氨酸原料药中这些杂质的报道。为了有效控制甘氨酸原料药的质量，保证用药安全，该实验采用HPLC法同时测定甘氨酸原料药中的上述5 种杂质，为原料药的质量控制提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

岛津LC-20AT 高效液相色谱仪；梅特勒320pH 酸度计；奥豪斯EX225DZH 十万分之一天平；抽滤装置、微孔滤膜（硝化纤维型，φ50 cm，孔径0.22 μm）；上海一恒科学仪器有限公司[4]。

甘氨酸3 批：由湖南宝利士生物技术有限公司提供，甘氨酸酐（含量≥98%，标准物质），亚氨基二乙酸（含量≥98%，标准物质，），2-氯乙酸（含量≥98%，标准物质），双甘肽（含量≥98%，标准物质），三甘氨肽（含量≥98%，标准物质），以上标准物均有Sigma 公司提供。庚烷磺酸钠、磷酸（均为分析纯）：天津科密欧化学试剂有限公司，超纯水：由DZG-303A 艾科超纯水机制得，乙腈（HPLC 级）：Merck 公司[5]。

1.2 溶液的配制

流动相溶液：称取庚烷磺酸钠2.24 g，加水975 mL 溶解后，用磷酸调节pH 值至2.2，过滤后，再加入25 mL 乙腈，超声。

稀释剂溶液：同流动相溶液。

对照品储备溶液：称取各组分杂质对照品约25 mg，精密称定，置50 mL 量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度。（溶液浓度为500 μg/mL）。

各组分对照二级储备液：精密量取各组分对照品贮备液0.5 mL，置10 mL 量瓶中，加稀释剂稀释至刻度。（溶液浓度为25 μg/mL）。

对照品溶液：称取甘氨酸25 mg 和各组分对照品二级贮备液1.0 mL，置于同一50 mL 量瓶中，加稀释剂稀释至刻度。

各组分对照溶液：精密称取杂质甘氨酸酐、亚氨基二乙酸、2-氯乙酸、双甘氨肽、三甘氨肽对照品各约10 mg，分别至5 个50 mL 容量瓶中，加溶剂溶解后稀释至刻度，摇匀，分别作为各组分的对照溶液。（溶液浓度为0.5 mg/mL）。

供试品溶液：称取该品约25 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度。

80%限度加标供试品溶液：精密称取甘氨酸25.0 mg，加入50 mL 容量瓶中，加入各组分对照品二级贮备液0.8 mL，加稀释剂稀释至刻度，平行制备3 份。

100%限度加标供试品溶液：精密称取甘氨酸25.0 mg，加入50 mL 容量瓶中，加入各组分对照品二级贮备液1.0 mL，加稀释剂稀释至刻度，平行制备3 份。

120%限度加标供试品溶液：精密称取甘氨酸25.0 mg，加入50 mL 容量瓶中，加入各组分对照品二级贮备液1.2 mL，加稀释剂稀释至刻度，平行制备3 份。

1.3 分析方法

色谱柱CenturySIL C18-AQ（5 μm，4.6 mm×250 mm），流动相（含2.24 g/L 庚烷磺酸钠，用磷酸调节pH 值至2.2）-乙腈（97.5 ∶2.5），检测波长为200 nm，流速为1 mL/min，进样量20 μL，柱温25 ℃。

2 结果

2.1 系统适用性与仪器精密度

将对照品溶液连续进样6 针，考察各峰间的分离度、理论塔板数、拖尾因子、各峰保留时间的RSD、各峰峰面积的RSD。结果表明，在该条件下各峰间的分离度≥1.5，理论塔板数≥2 000，拖尾因子≤2.0。各峰保留时间RSD ≤1%，主峰面积RSD ≤2%，杂质峰面积RSD ≤10%。结果见表1，色谱图如图1 所示。

表1 系统适用性与仪器精密度试验结果

2.2 定量限

取各成分对照品溶液，用稀释剂不断稀释，精密量取20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，直至峰信噪比（S/N）≥10，计算各成分定量限和定量限浓度。配制6 份定量限溶液，精密量取上述溶液各20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图。计算各成分峰面积RSD 和保留时间RSD。

结果表明：信噪比（S/N）≥10，6 份定量限溶液中各峰的保留时间RSD ≤1.0%，峰面积RSD ≤10%。定量限测定结果见表2。

表2 定量限测定结果

2.3 检测限

取定量限项下的定量限溶液，用稀释剂稀释，精密量取20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图，当信噪比（S/N）≥3，计算各成分检测限和检测限浓度。

检测限测定结果见表3。

图1 液相色谱图

表3 检测限测定结果

2.4 线性与范围

精密量取对照品二级贮备液（25 μg/mL）0.3 mL、0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL 和1.2 mL，分别置50 mL 量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液各20 μL 注入液相色谱仪，记录色谱图。

对上述溶液的浓度（x）与相应的峰面积（y）作线性回归，计算回归方程及其相关系数R、斜率K、截距。

结果表明各组分在00.6 μg/mL～0.6 μg/mL 浓度范围内（相当于测定浓度0%～0.12%，相当于含量0%～0.12%，相当于限度浓度0%～120%），峰面积与浓度呈线性关系（R ＞0.998）。回归方程与线性范围见表4。

表4 各杂质回归方程及相关系数

2.5 准确度

按照“1.3”介绍的方法，分别取供试品溶液、80%限度加标供试品溶液、100%限度加标供试品溶液、120%限度加标供试品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，以外标法测定并计算含量，杂质甘氨酸酐、亚氨基二乙酸、2-氯乙酸、双甘氨肽、三甘氨肽9 次测定的平均回收率分别为100.23%、98.58%、98.68%、99.69%、99.97%，RSD 值分别为1.20%、0.33%、0.86%、1.15%、0.82%。结果表明，该方法准确度均良好。

2.6 耐用性

分别调节流速为0.8 mL/min 与1.2 mL/min、柱温20 ℃与30 ℃、pH=2.1 与pH=2.3、流动相比例缓冲液∶乙腈=98.5 ∶1.5 和缓冲液：乙腈=96.5 ∶3.5 时，进样对照品溶液，结果表明，在上述各条件下进行试验，甘氨酸色谱峰与各杂质分离度均大于1.5，该方法耐用性良好[6]。

2.7 溶液稳定性

取供试品溶液于25 ℃自动进样器中，按照“1.3”介绍的方法，分别在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h 进样分析，考察供试品溶液的稳定性。结果表明，各杂质在8 h 放置时间内，含量相对稳定。因此，供试品溶液配制完成后可在8 h 内测定。

2.8 供试品有关物质测定

取该品3 批，按照“1.2”介绍的供试品溶液的配制方法，按照“1.3”介绍的方法进行测定，杂质甘氨酸酐、亚氨基二乙酸、2-氯乙酸、双甘氨肽、三甘氨肽以外的标法计算有关物质含量，其他单个最大杂质与总杂质以面积归一化法测定，结果见表5。结果显示，3 批甘氨酸有关物质测定结果均符合要求。

表5 甘氨酸有关物质测定结果

3 讨论

该研究对甘氨酸中有关物质的检测条件进行了优化，筛选了不同类别的色谱柱及流动相条件，最终以CenturySIL C18-AQ 作为分析柱时，色谱峰出峰快，分析周期短，基线平稳，且分离度各项指标满足要求，色谱柱廉价、节约成本。由于甘氨酸及各杂质均为两性化合物，分子极性较大，在C18 固定相中的保留较弱，在方法开发的过程中，加入了离子对试剂庚烷磺酸钠，其庚烷基与色谱柱的固定相吸附结合，暴露出磺酸基负离子，吸附流动相中的阳离子被分析物，增强阳离子化合物的保留。该试验中通过调节流动相pH 值，实现了甘氨酸和各杂质的有效分离。同时研究还发现，随着柱温的升高，各成分出峰时间缩短，柱温为20 ℃、25 ℃、30 ℃时，各色谱峰之间均能满足分离的要求，综合考虑选定柱温为25 ℃。随着流速的增加，各成分出峰时间缩短，各色谱峰之间满足分离的要求，选定流速为1.0 mL/min。该方法简便、准确，能够为甘氨酸的质量控制提供依据。