营养条件和温度对利福霉素B生产强度的影响

孙新强,陈克杰,杨一恭,王红伟,陈迎迎,周旭燕,邵 东,徐作武

(1.浙江昌海制药有限公司,浙江 绍兴 312366;2.浙江医药股份有限公司 新昌制药厂,浙江 绍兴 312500)

利福霉素B(Rifamycin B)为地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsismediterranei)分泌的5种利福霉素组份(A,B,C,D,E)中酸性最强、性质最稳定、容易分离、最易制得的组份,可氧化成利福霉素O,并进一步合成其他用于治疗分枝杆菌感染导致的结核病、麻风病的衍生物[1]。随着结核病发病率的上升及利福霉素类抗生素新适应症的拓展,下游对原料药的需求逐步提升。为了进一步提升利福霉素B的产量和生产强度,需深入解析菌株特性[2],进行菌株改造[3],并运用生化工程策略充分挖掘菌株的潜力[4-6]。Verma等[2]对地中海拟无枝酸菌S699进行全基因组测序,有助于深层次理解菌株特性和预测相关功能。Priscila等[3]将来源于粪透明颤菌(Vitreoscillastercoraria)的血红蛋白基因vhb表达在利福霉素B高产菌株中,具有vhb基因的转化子发酵摇瓶产量较亲本提高29.5%。Bapat等[7]提出了一个结构模型解释了在多底物复合培养基中利福霉素B发酵的菌体生长和合成动力学,表明葡萄糖和硫酸铵对菌株生长和产物形成有明显的抑制作用。孟根水等[8]通过控制温度、溶氧并采用流加补料工艺,发酵效价提高一倍以上。为了提升利福霉素B的生产强度并进一步巩固本司在该产品上的技术与成本竞争优势,笔者在更接近发酵罐培养模式的补料摇床上进行培养基关键成份优化,针对如何进一步提升发酵中期溶氧水平提出了两阶段温度培养模式,并将上述结果在10 m3中试发酵罐上进行工艺放大,为车间商业化大生产提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

地中海拟无枝酸菌(Amycolatopsismediterranei)XC-301,保藏于浙江医药股份有限公司新昌制药厂生物药物实验中心。

1.1.2 培 养 基

固体培养基(质量浓度):酵母抽提物4.0 g/L,麦芽抽提物4.0 g/L,葡萄糖4.0 g/L,燕麦片20 g/L,琼脂20 g/L。

种子培养基(质量浓度):葡萄糖15 g/L,熟黄豆粉10 g/L,玉米淀粉15 g/L,大豆蛋白胨10 g/L,KH2PO40.5 g/L,KNO31.0 g/L,CaCO32.0 g/L,泡敌4.0 g/L。

初始发酵培养基(质量浓度):葡萄糖120 g/L,大豆蛋白胨10 g/L,熟黄豆粉10 g/L,鱼粉5.0 g/L,KNO34.0 g/L,(NH4)2SO45.0 g/L,KH2PO40.5 g/L,CaCO33.0 g/L,1.0 g/LCoCl2溶液1.0 g/L,泡敌0.4 g/L。

补料培养基(质量浓度):葡萄糖500 g/L。

种子和发酵培养基消前pH值自然;所有培养基碳源、氮源分消,灭菌条件为121 ℃,30 min。

1.1.3 仪器与设备

SW-CJ-IFD型超净工作台,苏州净化设备有限公司;UV-2600A型紫外可见分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司;BIOTECH-30JS种子罐,上海保兴生物设备工程有限公司;LiFlus SP-70L发酵罐,韩国百特伦(Biotron)公司;1 m3种子罐、10 m3发酵罐,江苏远方迪威尔设备科技有限公司;SBA-40C型葡萄糖测定仪,山东省科学院生物研究所;BLBIO-HYG-1000型补料摇床,上海百仑生物科技有限公司;

1.2 试验方法

1.2.1 培养方法

固体培养:取-80 ℃冰箱保藏的冷冻甘油保藏液,融化后用接种环蘸取解冻液,进行平板划线,于温度(30±0.5) ℃、湿度30%～60%条件下培养6～8 d。

种子瓶培养:在成熟斜面上挖取5 mm×20 mm孢子接种种子培养基(80 mL/750 mL三角瓶),在转速220 r/min、温度(30±0.5) ℃条件下振荡培养48 h。

补料摇床培养:将成熟种子瓶培养液按体积分数10%接发酵培养基(250 mL/1 000 mL补料摇瓶),在通气量0.015 m3/h、温度(30±0.5) ℃和转速220 r/min条件下振荡培养192～216 h。

30 L种子罐培养:取成熟种子瓶培养液,按体积分数0.5%～2.5%接种子培养基(20 L/30 L种子罐),于温度(30±0.2) ℃、搅拌转速250 r/min、通气量1.8 m3/h和罐压0.05 MPa条件下培养72 h。

70 L发酵罐培养:将成熟种子罐培养液按体积分数10%移发酵罐(30 L/70 L发酵罐),培养温度(30±0.2) ℃,通气量1.8～4.5 m3/h,罐压0.05～0.1 MPa,全程用25%～28%氨水控制pH值6.4±0.02,溶氧通过搅拌转速、通气量和罐压的共同调节维持在25%～35%。补料控制参考文献[8]的流加补料,即当葡萄糖残留低于30 g/L时,开始补加50%的葡萄糖,维持葡萄糖残留质量浓度为10～15 g/L之间。定期取样测定菌体体积分数、葡萄糖残留质量浓度和利福霉素B效价。

1 m3种子罐培养:取成熟种子瓶培养液,按体积分数0.5%～2.5%接种子培养基(0.5 m3/1 m3种子罐),于温度(30±0.2) ℃、搅拌转速200 r/min、通气量45 m3/h和罐压0.05 MPa条件下培养72 h。

10 m3发酵罐培养:将成熟种子罐培养液按体积分数10%移发酵罐(4.5 m3/10 m3发酵罐),培养温度(30±0.2) ℃,通气量225～450 m3/h,罐压0.04～0.07 MPa,全程用25%～28%氨水控制pH值6.4±0.05。起始搅拌转速80 r/min,当溶氧低于25%时每次提高搅拌转速10～20 r/min,控制溶氧在25%以上。当葡萄糖残留低于30 g/L时,通过质量流量计连续补加50%葡萄糖,维持葡萄糖质量浓度在10～20 g/L之间。

1.2.2 测定方法

利福霉素B效价测定:采用分光光度法测定[1]。

菌体体积分数(PMV)检测:参考文献[8]。

氨基氮检测:按照甲醛法测定[1]。

葡萄糖检测:采用SBA-40C型葡萄糖测定仪检测。

2 结果与讨论

2.1 初始葡萄糖质量浓度对利福霉素B合成的影响

发酵培养基原配方初始葡萄糖质量浓度为120 g/L,高糖质量浓度会影响发酵液的流变性、黏度,对溶氧传质和抗生素合成造成影响[7,9]。因此,在补料摇瓶中设置不同的初始葡萄糖质量浓度,当检测葡萄糖残留质量浓度达到20～30 g/L时,从补料起始至发酵结束恒速补加50%葡萄糖溶液,使葡萄糖总量均为250 g/L,考察初始葡萄糖质量浓度对利福霉素B合成的影响,实验结果如表1所示。

表1 初始葡萄糖质量浓度对利福霉素B合成的影响Table 1 Effects of initial glucose concentration on rifamycin B synthesis

① 为初始葡萄糖质量浓度;② 为过程补加质量浓度;③ 为发酵结束时的菌体体积分数;④ 为葡萄糖残留质量浓度;⑤ 为利福霉素B效价。

由表1可以得出:菌体体积分数与初始葡萄糖质量浓度呈负相关,过高的初始葡萄糖质量浓度会抑制菌丝分化;初始葡萄糖质量浓度为80 g/L时,补料摇瓶效价达到14 000 μg/mL以上,比140 g/L和60 g/L时效价分别高31.6%和16.0%;耗糖总量与利福霉素B效价正相关。综合上述葡萄糖消耗质量浓度、菌体体积分数和利福霉素B效价这3个指标,后续研究将初始葡萄糖质量浓度调整为80 g/L。

2.2 无机氮源组合对利福霉素B合成的影响

利福霉素B发酵培养基含有丰富的无机氮源KNO3和(NH4)2SO4,硝酸盐对地中海拟无枝酸菌具有“硝酸盐效应”,能增加利福霉素生物合成前体的供给和提升利福霉素合成酶基因的表达[10-11],而铵盐能够被菌体快速利用并促进菌体生长。在发酵培养基无机氮源总质量浓度9 g/L保持不变条件下,考察不同KNO3和(NH4)2SO4组合对菌体生长和效价的影响,结果如表2所示。

表2 无机氮源组合对利福霉素B合成的影响Table 2 Effects of inorganic nitrogen sources ratio on rifamycin B synthesis

① 为KNO3质量浓度;② 为(NH4)2SO4质量浓度。

2.3 基质质量比对利福霉素B合成的影响

在调整初始葡萄糖质量浓度和无机氮源组合的基础上,设置各组初始葡萄糖质量浓度均为80 g/L,以无机氮源6 g/L的KNO3和3 g/L的(NH4)2SO4,其他成份与发酵培养基初始配方一致的实验组作为对照(基质质量比为100%),考察发酵培养基基质质量比的影响,结果如表3所示。

表3 基质质量比对利福霉素B合成的影响Table 3 Effects of fermentation medium concentration on rifamycin B synthesis

① 为发酵培养基基质质量比。

由表3实验结果表明:随着基质质量比的增加菌体体积分数逐步升高,在基质质量比为对照组的115%时,利福霉素B效价达到(16 143±319) μg/mL,较对照(100%组)提高4.63%,继续增加基质质量比到130%,效价降低。分析基质质量比为130%组摇瓶溶氧情况发现:发酵中后期溶氧水平较低,可能高基质质量比造成菌体体积分数过高从而引起供养水平下降,效价降低。

2.4 两阶段温度控制提升利福霉素B产量

溶氧作为关键的发酵控制参数,对氧依赖型目标产物的合成具有决定性的影响[12],相关报道[1,3]及本司生产经验表明:维持溶氧25%以上,对于利福霉素B的合成是必需的。在生产实践中,在特定的压缩空气系统和现有的发酵设备体系下,影响供氧水平的空气流量、罐压和搅拌功率是限定的,因此提高溶氧水平必须通过调节菌体的生理特点实现。两阶段温度控制模式作为抗生素常用的工艺控制策略,可减缓菌丝衰老,有利于效价提高[13],特别是发酵中后期有利于提高溶氧水平。因此,在70 L发酵罐上比较了30 ℃和25 ℃恒温培养,生长期30 ℃中后期25 ℃培养,对利福霉素B合成的影响(图1)。

图1 利福霉素B发酵恒温和变温培养搅拌及溶氧变化Fig.1 Profiles of agitation and dissolved oxygen during rifamycin B fermentation in constant temperature and temperature-variable cultivation

由图1可以得出:地中海拟无枝酸菌在70 L发酵罐上30 ℃恒温培养时,在92～155 h之间有一个溶氧低谷,此时供氧水平虽已达到最大,但仍无法满足细胞在优化培养基中对氧气的需求。在较低温度25 ℃培养时,菌体生长速率明显降低,最高菌体体积分数仅为42%,搅拌转速450～480 r/min即能满足菌体对溶氧的需求,效价仅为(18 715±292) μg/mL。采用两阶段变温培养工艺,即前期培养温度为30 ℃,在菌体体积分数达到50%以上,特别是92～155 h间将培养温度降低到25 ℃培养,能降低低谷期菌体耗氧而弥补供氧不足,利福霉素B效价达到(25 849±204) μg/mL,较30 ℃恒温时培养提高6.11%。相关发酵参数归纳如表4所示。

表4 恒温和变温培养对利福霉素B合成的影响Table 4 Effects of constant and temperature-variable cultivation on rifamycin B synthesis

2.5 10 m3中试罐利福霉素B发酵工艺放大

将获得的培养基优化配方和变温培养工艺在10 m3发酵罐上进行中试稳定性试验,实验结果如表5所示。

表5 10 m3发酵罐利福霉素B中试工艺稳定性验证Table 5 Stability verification of rifamycin B fermentation in 10 m3 fermenter

由表5可以明显得出:经过工艺优化后,在10 m3发酵罐上进行5批次中试稳定性实验,利福霉素B效价达到(25 647.6±326.6) μg/mL,比优化前提高了16.6%,对应的单罐产量达到(189.8±3.5) kg,中试发酵水平达到70 L发酵罐规模相同的工艺水平。Elsedawy等[14]报道了遗传改造的Amycolatopsismediterranei-RCP 1001菌株经培养条件优化,在6.6 L发酵罐上分批补料发酵,利福霉素B质量浓度达到24.8 g/L。与上述报道技术比较,本司在不改变菌株的条件下,仅仅通过生化工程策略就达到同等水平,在商业生产中更具有优势。

3 结 论

在更接近于发酵罐培养模式的补料摇床上研究了发酵培养基起始葡萄糖质量浓度、无机氮源组合和基质质量比,以期获得更适宜的发酵培养基配比与质量浓度。由于利福霉素B发酵的关键之一在于溶氧保证与菌体体积分数的辩证协调,因此期望在菌体体积分数达到最大后通过降温的方式使发酵体系摄氧率(OUR)下降,溶氧上升。在补料摇床上,总加糖为250 g/L时,最适初始葡萄糖质量浓度为80 g/L,利福霉素B效价达到(14 964±348) μg/mL;最适无机氮源组合为6 g/L的KNO3和3 g/L的(NH4)2SO4,利福霉素B效价达到(15 757±292) μg/mL;在基质质量比为115%时,利福霉素B发酵效价最高,达到(16 143±319) μg/mL;采用变温培养,即菌丝生长阶段采用30 ℃,在菌体体积分数达到50%以上,降温至25 ℃,降温不影响利福霉素B的合成且使发酵体系OUR下降,溶氧上升(92～155 h);在10 m3发酵罐上进行稳定性验证,利福霉素B效价为(25 647.6±326.6) μg/mL,单罐总量达到(189.8±3.5) kg。上述发酵培养基优化和变温培养策略提高了利福霉素B发酵生产强度,有利于车间技术经济水平提升。