青风藤复方颗粒药效学及急性毒性研究

郝赛恒,刘 学,凌 旺,胡海峰

(1.浙江工业大学 长三角绿色制药协同创新中心,浙江 杭州 310014;2.中国医药工业研究总院,上海 201203;3.国药集团健康产业研究院有限公司,上海 201203)

痛风是一种单钠尿酸盐(MSU)在关节及其周围组织沉积而诱发的反复发作性关节炎症性疾病,属代谢性风湿病范畴。本病主要生化基础为高尿酸血症,主要临床表现为关节红、肿、热和痛。痛风的治疗原则概括为迅速有效的缓解其急性发作,降低血尿酸,预防其反复发作[1-2]。

青风藤复方颗粒是本院根据现有文献报道及中药典籍选择21种药材,利用疼痛、肿胀和高尿酸动物模型对其镇痛、消肿和降尿酸活性进行大量体内筛选获得。该复方颗粒由青风藤、牛膝和甘草等药材组成,具有清热燥湿,祛瘀通络,健脾泄浊,消肿止痛之功效,用于治疗高尿酸血症和痛风。方中桂枝具有温经通脉、疏风通络和散寒止痛之效;赤芍可散瘀止痛、清热凉血,与桂枝经典配伍,共奏调和营卫、温通止痛之效,两药共为君药;青风藤具有祛风湿、通经络之效为臣药;佐以牛膝补肝肾、强筋骨,利水通淋,引热下行;甘草则为使药,有调和诸药之效,同时能够益气健脾,强化健脾之功。诸药合用,共达清热祛湿、祛瘀止痛、活血消肿和健脾益肾之功效[3-5]。笔者拟通过镇痛、抗炎、消肿、降尿酸试验及急性毒性试验,对青风藤复方颗粒的药效和毒性进行研究,为临床用药提供科学依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物

SPF级ICR小鼠,雄性,体重18～25 g,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供,动物许可证号:SCXK(沪)2013-0016。动物适应性饲养1周,自由进食、饮水。

1.2 药物与试剂

青风藤复方颗粒,由国药集团健康产业研究院有限公司提供;阿司匹林肠溶片,拜耳医药保健有限公司,批号:BJ44387;地塞米松乳膏,三九医药,批号:1611038H;秋水仙碱片,西双版纳版纳药业有限责任公司,批号:150801;苯溴马隆,德国赫曼大药厂,批号:H20130358;尿酸钠,Sigma-Aldrich公司,批号:P1343586;尿酸,上海沃凯化学试剂有限公司,批号:20180206;次黄嘌呤,国药集团化学试剂有限公司,批号:P1400392;尿酸试剂(氧化酶法),科华生物科技有限公司,批号:2016111H;冰醋酸、氢氧化钠、二甲苯,国药集团化学试剂有限公司,分析纯。

1.3 仪 器

JY系列多功能天平,上海衡平仪器仪表厂;KW-7C足趾容积测量仪,南京卡尔文生物科技有限公司;Allegra X-22R BECKMAN台式离心机,美国贝克曼库尔特有限公司;ZY-260全自动生化分析仪,科华生物科技有限公司。

2 实验方法

2.1 青风藤复方颗粒的镇痛作用实验

60只ICR小鼠,随机分为6组,分别为空白对照组,模型组,阿司匹林阳性对照组(0.2 g/kg),青风藤复方颗粒高、中、低剂量组(6.42,3.21,1.60 g/kg),每组10只,空白对照组与模型组小鼠灌胃0.5%CMC-Na混悬液,其余给药组给予相应的药物溶液,给药20 mL/kg,连续给药5 d,末次给药1 h后,腹腔注射1.0%的冰醋酸溶液0.2 mL/只,其中空白对照组注射等体积的0.9% NaCl溶液,计数注射后15 min内小鼠扭体反应次数及潜伏期[6]。

2.2 青风藤复方颗粒的抗炎作用实验

50只ICR小鼠,随机分为5组,分别为模型组、地塞米松阳性对照组(0.1 g/次)及青风藤复方颗粒给药组,每组10只,测量小鼠右耳厚度记为0 h右耳厚度,测量位置为右耳正中部位,同一位点测量3次,取平均值;模型组小鼠灌胃0.5% CMC-Na混悬液,青风藤复方颗粒组给予相应的药物溶液,给药20 mL/kg,连续给药5 d;地塞米松阳性对照组小鼠右耳前、后两面均匀涂布地塞米松软膏0.1 g/次,间隔30 min重复1次,共涂布4次;末次给药1 h后,吸取二甲苯20 μL均匀涂布于小鼠右耳前、后两面,致炎后30 min使用游标卡尺分别测量各组小鼠右耳厚度并记录,并与其0 h右耳厚度进行比较,计算肿胀度及肿胀抑制率,其表达式为

2.3 青风藤复方颗粒的消肿作用实验

2.3.1 尿酸钠(MSU)晶体的制备

称取尿酸钠800 mg,加至浓度为1 mol/L的5 mL氢氧化钠中,再加入无菌生理盐水155 mL煮沸溶解,冷却至室温后,调节pH=7.2,600 r/min离心吸取上清,室温静置2 d使MSU晶体析出,离心弃上清得MSU晶体,临用前使用生理盐水配置成质量浓度为50 mg/mL的混悬液[7]。

2.3.2 青风藤复方颗粒的消肿作用研究

60只ICR小鼠,随机分为6组,分别为空白对照组、模型组、秋水仙碱阳性对照组(0.1 mg/kg)及青风藤复方颗粒给药组,每组10只,给药方式与剂量同“2.1”项,末次给药1 h后,将0.02 mL MSU结晶混悬液(质量浓度50 mg/mL)注射至小鼠右后胫附踝关节腔,空白对照组注射等量的0.9% NaCl溶液,采用足趾容积仪分别测量小鼠造模前和造模后3 h和6 h造模侧足趾容积计算足趾肿胀度,并进行炎症评分(肿胀度=造模后足趾容积-造模前足趾容积)。

炎症指数分级标准为0分,正常;1分,关节皮肤红斑,轻度肿胀,骨性标志可见;2分,关节明显红肿,骨性标志消失,但肿胀局限于关节部位;3分,关节以外肢体肿胀[8]。

2.4 青风藤复方颗粒的降尿酸作用实验

60只ICR小鼠,随机分为6组,分别为空白对照组,模型组,苯溴马隆阳性对照组(0.02 g/kg)及青风藤复方颗粒给药组,每组10只,给药方式与剂量同“2.1”项,末次给药30 min后,各组腹腔注射m(UA)∶m(HX)=1∶1的溶液(其中UA为造模剂尿酸,HX为次黄嘌呤),每10 g注射体积0.2 mL,空白对照组注射等量的0.9% NaCl溶液,注射造模剂45 min后,摘眼球取血0.5 mL,30 min后置低温离心机中离心(500 r/min)分离血清,采用全自动生化分析仪及原装配套试剂测定血清尿酸浓度。

2.5 青风藤复方颗粒的急性毒性实验

预实验以最大质量浓度的青风藤复方颗粒2.645 g/mL(以不堵塞灌胃针头为标准)和最大给药40 mL/kg,对小鼠灌胃给药,观察14 d,小鼠无一死亡,无法测出半数致死量LD50和最大耐受量MTD,所以改做小鼠的最大给药量MLD试验。

20只ICR小鼠,随机分为正常组和青风藤复方颗粒给药组,每组10只。禁食不禁水12 h,青风藤复方颗粒组小鼠灌胃药物质量浓度为2.645 g/mL的溶液,每次给药40 mL/kg,正常组给予等体积、等次数的生理盐水,1日内给药3次,给药间隔6 h。给药首日每次给药后0,2,4,6 h连续观察动物活动情况,并记录动物毒性反应和死亡情况,后续连续进行一般性观察14 d,测定小鼠体重变化和摄食量;死亡动物及观察期结束后仍存活动物进行大体解剖,观察主要脏器的改变,如发现肉眼可见病变进行病理组织学检查[9]。

2.6 数据统计与分析

3 实验结果

3.1 青风藤复方颗粒对冰醋酸致小鼠疼痛模型作用的影响

表1 小鼠疼痛模型作用结果Table 1 Effect of pain model in rats

① 扭体次数与模型组比较,**p<0.01;② 潜伏期与模型组比较,##p<0.01。

3.2 青风藤复方颗粒对二甲苯致小鼠耳肿胀急性炎症模型作用的影响

表2 小鼠耳肿胀急性炎症模型作用结果Table 2 Effects of acute inflammation model of ear swelling in rats

① 与模型组比较,**p<0.01,*p<0.05。

3.3 青风藤复方颗粒对MSU结晶致小鼠急性痛风性关节炎肿胀模型作用的影响

表3 小鼠急性痛风性关节炎肿胀模型作用结果Table 3 Effect of rat acute gouty arthritis swelling model

① 足趾肿胀度与模型组比较,**p<0.01;② 踝关节炎症指数与模型组比较,##p<0.01,#p<0.05。

3.4 青风藤复方颗粒对UA和HX致小鼠高尿酸模型作用的影响

表4 小鼠高尿酸模型作用结果Table 4 Effect of hyperuric acid model in rats

① 与空白组比较,##p<0.01;② 与模型组比较,**p<0.01。

3.5 青风藤复方颗粒的急性毒性作用的影响

结果如表5,图1,2所示。经口灌胃给予青风藤复方颗粒每日给药合计317.4 g/kg,给药当日小鼠呼吸急促,竖毛,肌张力降低,皮肤水肿,大便呈深黑色;两组小鼠行为活动与自主活动未见明显异常,角膜、翻正和牵张反射存在,无流泪、无眼球突出,对外界反应、外观、行为、反射、眼睑及腺体分泌等均未见异常,未观察到明显中毒症状;给药后14 d观察期间,各组外观、行为、呼吸和腺体分泌等均未观察到明显异常症状,排便在第3 d恢复正常;与正常组相比,给药组小鼠体重增长及摄食量变化趋势基本一致,差异无统计学意义(p>0.05);整个实验期间未发生动物死亡,观察期结束后进行大体解剖,主要脏器组织及胸腔、腹腔未检出肉眼可见病变。由此可见,青风藤复方颗粒灌胃给药的最大给药质量分数为94.07%,相当于推荐人临床日用剂量的99倍。

表5 小鼠急性毒性实验观察表Table 5 Observation table of acute toxicity in rat

图1 青风藤复方颗粒急毒试验对小鼠体重的影响Fig.1 Effect of acute toxicity test of Qingfengteng compound granules on ratbodyweight

图2 青风藤复方颗粒急毒试验对小鼠摄食量的影响Fig.2 Effect of acute toxicity test of Qingfengteng compound granules on food intake in rat

4 结 论

通过药效实验和急性毒性试验,对青风藤复方颗粒的有效性和安全性进行初步研究。药效学结果表明:该制剂可显著改善冰醋酸致扭体反应情况,对二甲苯致炎症及MSU结晶致肿胀有明显抑制作用,对高尿酸模型小鼠表现出显著的降尿酸作用;急性毒性试验方面,测得青风藤复方颗粒的最大给药质量分数为94.07%,相当于推荐人临床用量的99倍,说明该药毒性较小。综上所述,该制剂有良好镇痛、抗炎、消肿和降尿酸作用,可用于高尿酸血症及痛风的防治或治疗,且急性毒性试验显示该药毒性低、安全性高,为其临床应用提供了有利的实验依据。