贵州地方鸡IL8RB基因多态性及其对肉品质的影响

吴 磊, 覃媛钰, 谭光辉, 李杰章, 张依裕, 蒋会梅, 杨远清, 向程举

(1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025；4.毕节市畜禽遗传资源管理站，贵州 毕节 551700)

IL-8属于C-X-C亚家族，是一种非常重要的趋化因子，具有介导细胞在炎症部位聚集、活化以及修复损伤的组织，刺激中性粒细胞和淋巴细胞发生趋化游走等功能[1-2].趋化因子是一种普遍存在的小分子量趋化蛋白，通过免疫调节细胞在感染期间迁移到感染部位进而参与宿主防御[3].IL8R 属于视紫红质 G-蛋白偶联受体超家族，有两种类型的基因，分别为IL8RA(只与IL-8有高度亲和力)和IL8RB(能高度结合其他趋化因子)[4-5].研究表明，2种受体的氨基和羧基显著不同，氨基的不同导致2种受体功能和作用有大的特异性[6].鸡的白细胞介素8受体(interleukin-8 receptor bata, IL8RB)基因定位于7号染色体，全长2 981 bp，由2个外显子和1个内含子组成.IL8RB基因具有介导活化中性粒细胞的作用，可促进中性粒细胞脱颗粒，释放贮存酶，增强中性粒细胞的吞筮功能，启动超氧离子释放，导致机体局部发生炎症反应，达到杀灭病原菌的目的[7].Matsushima et al[8]检测到IL8RB基因与许多实体肿瘤的耐药性、侵袭和转移相关，可能影响家禽抗逆性.Luppi et al[9]证实IL8RB基因通过受体酪氨酸激酶磷酸化激活生长因子信号反应，能导致细胞增殖、迁移和转移的增强.综合前人研究结果可知，IL8RB基因是与某些疾病相关的基因，可能与家禽抗逆性有很大联系，但关于畜禽IL8RB基因多态性的研究报道极为少见.

本研究以贵州地方鸡种长顺绿壳蛋鸡、黔画乌鸡和威宁鸡为研究对象，采用DNA直接单个测序筛选IL8RB基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点，计算其单倍型、双倍型与蛋壳品质的关联性，探讨IL8RB基因突变与黔画乌鸡肉品质的联系，旨在为今后进一步研究该基因对鸡肉品质及生理功能的影响提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验动物及样品采集

长顺绿壳蛋鸡110只(♂38，♀72)、黔画乌鸡55只(♂15，♀40)和威宁鸡76只(♂26，♀50)均随机采自贵州大学家禽研究所科研鸡场.鸡只均健康无病，通过翅静脉采血和抗凝肝素钠抗凝的方式采集血样0.5～1.0 mL，按照DNeasy Blood & Tissue Kit(250)试剂盒说明书的方法逐只提取血样基因组DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用NanoDrop 2000型核酸浓度检测仪(美国NanoDrop公司)测定其浓度，并稀释成终浓度为50～100 ng·μL-1，置-20 ℃保存备用.屠宰全部黔画乌鸡，取胸肌组织，参照李利等[10]的方法测定鸡肉品质.

1.2 引物设计

根据GenBank收录的鸡IL8RB基因序列(NC-006094.5)，采用网上引物设计软件Primer3 Input (version 0.4.0)设计3对引物，引物信息见表1.F1/R1扩增区域包括外显子1、F2/R2和F3/R3扩增区域包括外显子2，引物由昆泰锐(武汉)生物技术有限责任公司合成.

1.3 PCR扩增

3对引物采用相同的PCR反应体系和扩增程序.PCR反应体系：1 μL基因组DNA模板、上游引物(10 μmol·L-1)和下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL、10 μL 2×Es Taq MasterMix、7 μL双蒸水，总体积为20 μL.PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min， 94 ℃变性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环，72 ℃终延伸6 min.待反应结束后，把PCR反应产物用移液枪加在1.5%琼脂糖槽中进行凝胶电泳，电泳仪电压设置为135 V，电泳时间设定为30 min，电泳完成后立即放到凝胶成像仪上拍照，查看结果并截图保存.选取特异性较好的PCR扩增产物送往昆泰锐(武汉)生物技术有限责任公司测序.

表1 IL8RB基因的引物序列

1.4 mRNA二级结构和蛋白质高级结构的预测

利用在线软件RNAfold (http：//nibiru.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)对IL8RB基因突变前后编码区序列mRNA的二级结构进行预测；利用在线软件SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测和分析IL8RB基因编码区突变前后蛋白质的二级结构；利用在线软件SWISS-MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive)预测IL8RB基因编码区突变前后蛋白质的三级结构.

1.5 统计分析

运用SHEsis网上在线软件(http://analysis.bio-x.cn/)计算SNP位点的基因型频率、等位基因频率、单倍型频率、基因型分布卡方值(χ2)、连锁不平衡的D′和r2值.根据Nei et al[11]和Botstein et al[12]的报道计算观察杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC).运用SPSS 19.0软件中的一般线性模型分析SNP位点基因型或双倍型与所测定性状指标的相关性，模型为Y=μ+G+e(Y为性状观测值，G为基因型效应或双倍型效应，μ为群体均值，e为随机残差).采用最小显著性差异法(LSD)进行多重比较，结果用平均值±标准差表示.

2 结果与分析

2.1 IL8RB基因SNP的筛查与鉴定

对IL8RB基因PCR产物进行直接测序，序列比对结果(图1)表明，共发现2个SNP变异位点g.22589443 C>T和g.22589512 C>T，均处于IL8RB基因外显子2的错义突变(3个鸡种变异位点一致).g.22589443 C>T突变共产生3种基因型，引起亮氨酸变成丝氨酸；g.22589512 C>T突变共产生2种基因型，引起苏氨酸变成甲硫氨酸.

2.2 IL8RB基因SNP位点的遗传特性

对IL8RB基因在长顺绿壳蛋鸡、黔画乌鸡和威宁鸡鉴定到的3个SNP位点进行遗传特性分析.结果(表2)显示，3个鸡品种g.22589443 C>T位点中的CC基因型和C等位基因分别为优势基因型和优势等位基因，杂合度和有效等位基因数较高，多态信息含量属于中度多态位点，长顺绿壳蛋鸡g.22589443 C>T位点的基因型分布极显著偏离了Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)，而黔画乌鸡和威宁鸡显著偏离了Hardy-Weinberg平衡(P<0.05).3个鸡品种g.22589512 C>T位点中的CC基因型和C等位基因分别为优势基因型和优势等位基因，杂合度和有效等位基因数较低，属低度多态，基因型分布均未偏离平衡状态(P>0.05).

表2 IL8RB基因SNP位点的群体遗传特性1)

2.3 IL8RB基因SNP位点的连锁不平衡分析

对长顺绿壳蛋鸡、黔画乌鸡和威宁鸡IL8RB基因2个SNP位点g.22589443 C>T和g.22589512 C>T进行连锁不平衡分析.结果(表3)显示，2个SNP位点的D′值均为1，r2值小于0.33，根据Ardlie et al[13]和Slatkin[14]的报道，当|D′|>0.8和r2>0.33时认为SNP位点间存在强连锁不平衡，揭示了本研究发现的2个SNP位点间不存在强连锁不平衡.

表3 IL8RB基因SNP位点的连锁不平衡D′和r2值

2.4 IL8RB基因单倍型及双倍型分析

对长顺绿壳蛋鸡、黔画乌鸡和威宁鸡IL8RB基因的2个SNP位点进行单倍型和双倍型分析.结果(表4)显示，在检测的3个鸡群体IL8RB基因中，g.22589443 C>T和g.22589512 C>T位点共存在3种单倍型和4种双倍型，单倍型H1(CC)和双倍型H1H1(CCCC)出现的频率最高，单倍型H3(CT)和双倍型H2H2(TTCC)出现的频率最低.

2.5 IL8RB基因生物信息学分析

就长顺绿壳蛋鸡、黔画乌鸡和威宁鸡IL8RB基因外显子2上的g.22589443 C>T和g.22589512 C>T位点组合对mRNA序列二级结构的影响进行预测.结果(图2)显示，CC组合mRNA序列结构的自由能为-2 415.74 kJ·mol-1，TC组合的自由能为-2 412.81 kJ·mol-1，CT组合的自由能为-2 431.23 kJ·mol-1，稳定性为：CT>CC>TC，TC与GenBank上收录的序列相同，揭示突变使自由能降低，稳定性升高.对蛋白质二级结构和三级结构分析发现，2个SNP位点引起氨基酸变化但并未引起蛋白质结构变化.

2.6 IL8RB基因变异位点对黔画乌鸡常规肉质指标的影响

IL8RB基因变异位点g.22589443 C>T和g.22589512 C>T与黔画乌鸡肉品质的关联性分析结果(表5)显示， 2个SNP位点对黔画乌鸡肉品质指标的影响均不显著(P>0.05),双倍型H1H1(CCCC)个体的肉色指标显著高于H1H3(CCCT)个体(P<0.05)，其他双倍型各指标之间的差异均不显著(P>0.05).

表4 IL8RB基因SNP位点的单倍型和双倍型频率

表5 IL8RB基因变异位点与黔画乌鸡常规肉质指标的关联性1)

1)肉质的各项指标均在屠宰后40 min内测定；同列数据后附不同字母者表示差异显著(P<0.05)，附相同字母者或无字母者表示差异不显著(P>0.05).

3 讨论

随着人们生活水平的快速提高，对禽品质的要求也越来越高，通过提高家禽抗逆性，培育出安全优质的禽产品，可以满足人们对高品质禽产品的需求[15].通过多个数据库检索发现，IL8RB基因是与畜禽抗逆性有关的基因，但有关畜禽IL8RB基因的多态对生产性能的影响极少报道.IL8RB基因主要分布于中性粒细胞和髓样前体细胞系中，具有介导活化中性粒细胞的作用，可促进脱颗粒，释放贮存酶，增强吞噬功能，启动超氧离子释放，导致机体局部炎症反应，达到杀灭病原菌的目的[16-17]，IL-8真核表达质粒作为免疫增强剂能够显著提高家禽的抗体效价水平[18].目前，已经在人体IL8RA基因中鉴定出了SNP，并发现这些SNP与炎性疾病相关，并且已经显示其在不同的地理种群中有所不同[19-20].徐敏等[21]报道，CXCR2基因可以作为影响牛乳房炎和奶品质性状的可能主要候选基因，并将SNP+777和SNP+861两个多态位点用于抗乳房炎性状的选择.本研究以贵州地方鸡种长顺绿壳蛋鸡、黔画乌鸡和威宁鸡为材料，对IL8RB基因进行SNP检测，在IL8RB基因外显子2上共筛选出2个SNP变异位点g.22589443 C>T和g.22589512 C>T.g.22589443 C>T突变共产生3种基因型，引起亮氨酸变成丝氨酸；g.22589512 C>T突变共产生2种基因型，引起苏氨酸变成甲硫氨酸.g.22589443 C>T突变位点的杂合度和有效等位基因数较高，为中度多态，更利于遗传选择，在今后的遗传选育工作中获得更大遗传进展的潜力更大[22].2个SNP位点联合产生3种单倍型和4种双倍型，理论上应有4种单倍型和10种双倍型，实际观察值与理论值存在差异，可能由长期人工选育、样本量不够或者根本不存在另外一种单倍型引起的.基因在配子中的随机分离及在合子中的随机重组都会导致一定的误差，引起基因频率的变化，即随机漂变引起基因频率偏离Hardy-Weinberg平衡[23].本研究中,g.22589443 C>T位点的基因型分布在长顺绿壳蛋鸡中极显著偏离了Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)，在黔画乌鸡和威宁鸡中显著偏离了Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)；而g.22589512 C>T位点的基因型分布在3个鸡种群中均未偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05).表明g.22589443 C>T位点可能受到遗传漂变、突变或者人工选育等因素的影响[24].r2和D′值反映了连锁不平衡的不同方面，D′值仅包括重组史，而r2值包括了重组史和突变史以及诸如自然或人工选择、基因转换、遗传漂变等可以影响连锁不平衡的历史事件，D′值不适宜小样本的研究应用，r2值小于0.33时，位点之间不存在强连锁不平衡[25]，表明该基因2个SNP位点趋向独立遗传.基因突变使IL8RB基因mRNA最小自由能降低，稳定性升高，2个SNP位点虽然引起氨基酸变化，但蛋白质的二级结构和三级结构并未改变，蛋白质的功能与其空间结构有密切关系，因此，突变没有引起蛋白质功能和空间结构发生改变.对IL8RB基因变异位点与黔画乌鸡肉品质关联性的分析发现，H1H1(CCCC)个体的肉色指标显著高于H1H3(CCCT)个体(P<0.05)，且双倍型H1H1各项指标均在正常范围，双倍型H1H1是改善肉色的有利双倍型.今后可以加大对IL8RB基因SNP的研究并扩大筛查范围，对其多态性进行更深层次的探讨与分析，为鸡的保种选育提供参考.