4个无性系杉木叶挥发性成分的分析比较

于晓锐,刘云,罗旭璐,李丽萍,张加研,赵平*

(1.西南林业大学西南地区林业生物质资源高效利用国家林业和草原局重点实验室, 昆明 650224；2.西南林业大学西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，昆明 650224)

杉木(Cunninghamialanceolata)是我国主要速生用材树种，具有生长快、产量高、材性好、用途广泛等特性。由于无性繁殖具有保持亲本优良特性、林分整齐和便于育林的优点，杉木无性系选育已成为杉木造林种苗品质改良的重要途径，极大地推动了杉木人工林的建设[1-2]。杉木富含杉木精油，其精油的主要成分有柏木醇、α-柏木烯、β-柏木烯、龙脑等[3]，具有抗螨除菌、抗白蚁等功效[4-5]。有关杉木主要成分的研究，多围绕其心材、枝干、根等部位的提取方法展开[6-7]。李文珠等[6]采用不同提取工艺对杉木去皮碎料精油的提取差异性进行了研究，结果表明不同提取工艺精油得率差异明显，排序为干馏法>直接蒸汽蒸馏法>常压水中蒸馏法>减压蒸馏法。仲利涛等[7]利用超临界流体CO2萃取法对杉木心材精油的提取条件进行了探究，获得了超临界CO2流体萃取法的最优提取工艺。水蒸气蒸馏法与超临界CO2流体萃取法相比较，水蒸气蒸馏法操作成本较低，但超临界CO2流体萃取法具有工艺流程简单、萃取效率高、无有机溶剂残留等优点[8-9]，然而围绕不同无性系杉木挥发性成分的相关研究却鲜有报道。

近年来，气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)已被广泛应用于植物挥发性成分的分析[10-13]。吴青思等[10]从构造特征和挥发性成分的角度对交趾黄檀(Dalbergiacochinchinensis)和微凹黄檀(D.retusa)木进行了辨析。付宇新等[11]对不同化学类型的樟树(Cinnamomumcamphora)叶挥发油成分进行了GC-MS联用分析，发现不同化学类型樟树叶挥发性成分的组成及含量存在差异。

笔者以浙江省开化县采集的开化3号、开化13号、F24x那1-1和大坝8等4个无性系杉木叶为研究对象，分别采用水蒸气蒸馏和超临界CO2流体萃取法对其挥发油进行提取，运用GC-MS法对其化学成分进行分析，以期阐明各无性系杉木叶挥发油化学成分组成特点，并对4个无性系杉木叶挥发油提取率、化学成分组成和含量的差异进行比较，为杉木叶资源的综合开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

1998年种植的4个无性系杉木(开化3号、开化13号、F24x那1-1、大坝8)叶，于2017年11月采集于浙江省开化县国有林场，并记录各无性系杉木的树高和胸径信息。各无性系叶样品经阴干、粉碎、过3号筛(孔径为0.355 mm)处理后备用。无水乙醇、乙醚、正己烷等购自广东光华科技股份有限公司，均为分析纯。实验用水为自制超纯水。

1.2 主要仪器与设备

中药粉碎机(浙江瑞安永历制药机械有限公司)，BSA224S电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，水蒸气蒸馏装置和SPE-EDTMSFE-2型CO2超临界流体萃取装置(美国应用分离公司)，Agilent7890B型气相色谱仪、5977MSD检测器(美国安捷伦科技公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 挥发油提取

水蒸气蒸馏法：称取各无性系杉木叶粉末约300.00 g置于圆底烧瓶中，加蒸馏水2 L至完全浸没样品，加热提取至回流管内挥发油体积不再增加后，用适量乙醚抽提，乙醚溶液室温下挥发至无醚味，0.45 μm滤头过滤，置于4 ℃冰箱遮光保存备用。取各挥发油样品用正己烷溶解，0.45 μm滤头过滤，进样分析。

超临界CO2流体萃取法：称取各无性系杉木叶粉末约100.00 g，置于超临界CO2流体萃取仪反应釜中，在压力30 MPa、温度50 ℃条件下提取120 min，收集样品溶液后用含水正己烷萃取，减压浓缩干燥后称质量，置于4 ℃冰箱遮光保存。取各萃取物样品用正己烷溶解，0.45 μm滤头过滤，进样分析。

1.3.2 GC-MS分析

GC条件：HP-5MS石英毛细管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；进样口温度250 ℃，分流进样，分流比为10∶1；进样量1.0 μL；载气为高纯氦气，恒流，柱流速1.0 mL/min；柱温起始温度50 ℃(保留2 min)，以5 ℃/min升至220 ℃(保留10 min)。

MS条件：离子源为EI，离子化电压70 V，检测器电压0.9 kV，发射电流60 A，离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃；扫描范围15～500 u，溶剂延迟 2.5 min。

1.4 数据处理

根据GC-MS联用仪分析得出的总离子流图以及使用NIST MS数据库对匹配度达到90%及以上的挥发性成分进行谱库检索并结合文献进行分析。使用峰面积归一化法对挥发性成分相对含量(质量分数)进行计算：

相对含量=(检出物质峰面积/出峰总面积)×

100%。

2 结果与分析

2.1 不同提取方式下杉木叶挥发油提取率

采用水蒸气蒸馏和超临界CO2流体萃取法分别提取各无性系杉木叶中的挥发油，提取率如表1所示。从表1可以看出，水蒸气蒸馏法的平均提取率为0.05%～0.11%，超临界CO2流体萃取法的平均提取率为0.30%～0.52%。结果表明，超临界CO2流体萃取法的提取效果显著高于水蒸气蒸馏法。在4个无性系样品中，开化13号叶的精油提取率明显高于其他3个无性系，推测可能是由于各无性系之间的遗传差异所致。

表1 杉木叶挥发油提取率Table 1 Extraction rates of volatile oils from the Chinese fir leaves

2.2 不同提取方式下杉木叶挥发性成分组成差异分析

水蒸气蒸馏法和超临界CO2流体萃取法所得4个无性系杉木叶精油的总离子图如图1所示。由图1可以看出，样品检测基线平稳，检测方法稳定，检测出峰分离度好，信噪比在合理范围，符合挥发性成分的检测要求，可以进行数据分析。从挥发性成分总离子流信号可以看出，超临界CO2流体萃取法对样品中极性部分(保留时间20～28 min)的提取效果优于水蒸气蒸馏法，通过谱库匹配和查阅文献，获得了各无性系杉木叶挥发性成分的主要组成及相对含量[因版面限制，具体数据参见开放科学计划(OSID)附表1]，发现4个无性系挥发性成分的组成较为相似，但在含量上存在差异。

图1 4个无性系杉木叶挥发性成分总离子流图Fig. 1 The volatile components total ion chromatography of four Chinese fir clone leaves

2.2.1 水蒸气蒸馏法

采用水蒸气蒸馏法，从4个无性系杉木叶中共鉴定了75种挥发性成分，其中相对含量在1.00%以上的挥发性成分共有26种，包括烯烃类17种、醇类6种、酮类1种和其他类型2种，4个无性系杉木叶中的共有成分为41种。

从开化3号中共鉴定出挥发性成分52种，相对含量在1.00%以上的有15种，占总挥发性成分的58.79%。其中，β-月桂烯相对含量高达14.89%，β-桉叶烯7.10%，α-桉叶烯6.03%，香芹酮6.03%；其余11种成分的相对含量介于1.07%～3.26%。

从大坝8中共鉴定出挥发性成分59种，相对含量在1.00% 以上的有14种，占总挥发性成分的 83.08%。其中，10.00%以上的有3种，包括β-可巴烯19.95%，α-蒎烯14.03%和β-榄香烯12.14%；β-桉叶烯、α-桉叶烯和β-石竹烯3种成分的相对含量在5.00%以上；其余8种成分相对含量在1.01%～3.11%之间。

从开化13号中共鉴定出挥发性成分60种，相对含量在 1.00% 以上的有16种，占总挥发性成分的 87.21%。其中，10.00%以上的成分及相对含量有：α-蒎烯17.78%、β-可巴烯15.23%和d-柠檬烯14.48%；其余13种在6.00%以下。

从F24x那1-1中共鉴定出挥发性成分54种，相对含量在1.00%以上的有10种，占总挥发性成分的77.98%。其中，β-石竹烯的相对含量高达21.21%，在4个无性系中占比最高；β-榄香烯、β-桉叶烯、α-桉叶烯和α-蒎烯的占比在8.00%以上；其余成分均在2.00%以下。

β-月桂烯是一种天然存在于多种食物中的调味物质[14]，小鼠试验表明β-月桂烯可保护全脑缺血再灌注后心肌组织的氧化损伤和组织学损伤，可作为缺血性卒中后心肌组织安全的替代治疗方法[15]。与α-蒎烯、3-蒈烯和d-柠檬烯相比较，β-月桂烯对肿瘤坏死因子-α(TNFα)诱导的核因子κB(NF-κB)活性的抑制作用最强[16]。

2.2.2 超临界CO2流体萃取法

采用超临界CO2流体萃取法提取，从4个无性系杉木叶中共鉴定了挥发性成分75种，相对含量在1.00%以上的挥发性成分共16种，包括烯烃类10种、醇类4种和其他2种，4个无性系共有成分24种(附表1，见OSID)。

从开化3号中共鉴定出挥发性成分51种，相对含量在1.00% 以上的有14种，总挥发性成分的61.81%。其中，5.00%以上的有β-可巴烯10.04%、β-榄香烯9.25%、β-桉叶烯8.89%、β-石竹烯8.28%和α-桉叶烯6.92%；5.00%以下的有9种。

从大坝8中共鉴定出挥发性成分49种，相对含量在1.00% 以上的有12种，占总挥发性成分的59.73%。其中，β-可巴烯相对含量高达15.59%，其次为β-榄香烯14.75%，β-桉叶烯和β-石竹烯介于5.00%～10.00%；5.00%以下的有8种。

从开化13号中共鉴定出挥发性成分51种，相对含量在1.00% 以上的有14种，占总挥发性成分的62.48%。其中，β-可巴烯的含量达14.47%，与大坝8、开化3号相一致，占比最高。α-蒎烯、β-榄香烯、d-柠檬烯和β-石竹烯占比在5.00%～7.00%，相对含量5.00% 以下的有9种。

从F24x那1-1中共鉴定出挥发性成分40种，相对含量在1.00%以上的有8种，占总挥发性成分的61.27%。其中，10.00%以上的成分及相对含量有β-石竹烯16.42%、β-榄香烯13.27%、β-桉叶烯12.84%和α-桉叶烯10.00%，相对含量在1.00%～4.00%的有4种。

除无性系F24x那1-1外，其余3个无性系中β-可巴烯的相对含量均最高。β-可巴烯具有抗氧化能力，在神经退行性疾病领域具有减轻氧化损伤的作用[17]，且在人淋巴细胞培养中不具有基因毒性[18]。无性系F24x那1-1在2种提取方式下，β-石竹烯相对含量均最高，β-石竹烯可通过抗牙周病原菌改善牙周健康，还具有一定抗炎活性[19-20]。

2.3 不同提取方式下挥发性成分种类差异分析

水蒸气蒸馏法、超临界CO2流体萃取法所得的4个无性系杉木叶挥发性成分的种类差异分析结果如图2所示。由图2可以看出，水蒸气蒸馏法所得各无性系杉木叶挥发性成分如下：开化3号包括烯烃类34种(相对含量49.46%)、醇类13种(11.78%)、酮类1种(6.03%)和其他类型4种(0.80%)；大坝8包括烯烃类41种(83.96%)、醇类14种(5.45%)和其他类型4种(0.62%)；开化13号包括烯烃类39种(80.27%)、醇类14种(13.32%)、酮类2种(0.06%)和其他类型5种(0.74%)；F24x那1-1包括烯烃类32种(81.00%)、醇类13种(3.18%)、酮类2种(0.02%)和其他类型7种(3.92%)。4个无性系杉木叶中均以烯烃类居多，醇类次之，共有成分有41种，且不同无性系的挥发性成分相对含量和种类差异显著。开化3号中烯烃类的相对含量与其他3个无性系存在较大差异，可能与开化3号样品检测基线不太稳定有关(图1)。

超临界CO2流体萃取法所得各无性系杉木叶挥发性成分如下：开化3号包括烯烃类32种(58.73%)、醇类13种(8.01%)、酮类1种(0.02%)和其他类型5种(2.66%)；大坝8包括烯烃类25种(58.22%)、醇类13种(5.91%)、酮类3种(0.21%)和其他类型9种(2.19%)；开化13号包括烯烃类31种(59.43%)、醇类12种(9.19%)、酮类3种(0.23%)和其他类型5种(2.07%)；F24x那1-1包括烯烃类20种(59.06%)、醇类10种(3.19%)和其他类型10种(6.71%)。4个无性系杉木叶中均以烯烃类占比最多，共有成分有24种，其他类含量相差较小，成分种类差异不大。

图2 4个无性系杉木叶挥发性成分分类Fig. 2 Classification of volatile components of the leaves in four Chinese fir clones

3 结 论

采用2种不同的提取方式对浙江省开化县的4个无性系杉木叶的挥发性成分进行提取，通过GC-MS联用技术对所得提取物进行分析，结合试验和分析结果进行不同方法同种无性系、同种方法不同无性系的对比分析，结论如下：

1)2种提取方法中水蒸气蒸馏法提取成分极性较小，而超临界CO2流体萃取法提取效率更高。所提取的挥发性成分包括烯烃类、醇类、酮类以及其他类物质，2种提取方式提取挥发性成分相对含量在10%以上均为烯烃类，是杉木特殊香气的主要成分。

2)水蒸气蒸馏法检出的4个无性系杉木叶的挥发性主要成分有β-月桂烯、α-蒎烯、β-榄香烯、β-可巴烯、d-柠檬烯、β-石竹烯、α-桉叶烯和β-桉叶烯，其中F24x那1-1中β-石竹烯的相对含量高达21.21%。超临界CO2流体萃取法检出的4个无性系杉木叶的挥发性主要成分有β-可巴烯、β-榄香烯、β-石竹烯、α-桉叶烯和β-桉叶烯。结合主成分分析，可以看出4个无性系间挥发性成分是相似的，但不同提取方式所提取的挥发性成分的相对含量存在差异。