铅锌矿渣污染胁迫下苦楝光合-CO2响应过程及其模拟

易玄凯，康 慧，何志祥，黄鑫浩，朱 凡，

（1.中南林业科技大学，湖南 长沙 410004；2.南方林业生态应用技术国家工程实验室，湖南 长沙 410004）

铅锌工业的高速发展促使矿产资源大量开采，形成大面积的矿渣废弃地，导致周围地区土壤环境恶化，从而影响植物生长，危害人类健康[1]。为了改善土壤重金属污染问题，植物修复技术因其低成本、绿色环保等优点在工矿业废弃地被广泛应用[2-3]。

光合作用是植物生长的关键和基础，目前重金属对叶片光合作用的影响已有较多研究，结果表明，重金属胁迫下植物光合效率显著下降[4]。研究者发现重金属显著影响植物叶片光化学效率、电子传递速率以及光系统II 反应中心的结构和功能[5]。Bernardini 等[6]研究表明，Pb 和Zn 均影响芦苇的光合能力，但Zn 比Pb 影响更严重，陈良华等[7]发现Cd 胁迫下，美洲黑杨雌、雄株净光合速率、气孔导度、光系统II（PSII）最大光化学量子产量、最大电子传递速率等光合参数均不同程度下降。在碳同化过程中，CO2是个关键因子，大气中CO2到达叶绿体羧化位点除了会受到气孔导度和叶肉组织的阻力外，还会受到酶活性等生理生化过程的影响。Zhou 等[8]在研究Pb 对刺槐幼苗光合功能的影响表明，气孔导度是影响光合作用最主要的因素，Ahmad 等[9]研究表明高浓度Pb 对玉米光合速率的影响是非气孔限制。由此可见，重金属对碳同化过程的影响是由何种限制主导，目前仍不明确。

许多学者将直角双曲线模型[10]、Michaelis-Menten 模型[11]和直角双曲线修正模型[12]等经验模型和生化模型中应用最为广泛的FvCB 模型[13]用于研究水分胁迫、磷供给、干旱和温度胁迫等条件对光合作用的影响[14-15]，但将这些模型应用于研究重金属胁迫下植物CO2响应过程的模拟以及模型的适用性还未见相关研究报道。

苦楝Melia azedarach是楝科落叶乔木植物，是南方地区常见乡土树种，对土壤要求不严格，耐贫瘠，抗SO2，生长迅速。研究表明，苦楝在盐、低温、干旱、镉胁迫等条件下，具有一定的耐受性[16-17]。研究者发现一些木本树种如榉树、栾树等在铅锌胁迫下均具有一定的耐受性[18]，但关于铅锌胁迫下苦楝光合作用-CO2的响应还未见相关研究报道。本研究以2年生苦楝的实生苗为研究对象，测定其在铅锌矿渣与土壤不同质量比混合梯度下的光合作用-CO2响应曲线，使用Michaelis-Menten 模型、直角双曲线模型、直角双曲线修正模型和FvCB 生化模型进行模拟，明确铅锌胁迫下苦楝CO2响应过程的变化规律，分析不同CO2响应模型拟合铅锌胁迫下苦楝CO2响应过程及参数的适用性，同时定量分析光合作用下碳同化过程，为科学指导苦楝在铅锌矿渣废弃区的植物修复提供参考，同时为不同CO2响应模型的适用性评价提供试验证据。

1 材料与方法

1.1 研究材料与设计

本研究在湖南省长沙市中南林业科技大学温室进行。土壤均采自于中南林业科技大学校园内5～10 cm 表层土，无重金属污染历史，采回的土壤经过风干后过5 mm×5 mm 的筛，去除根、石头等杂物备用。铅锌矿渣采自湖南郴州一铅锌尾矿地。将土壤与铅锌矿渣按不同质量比混合设置成不同铅锌污染梯度（配置比例见表1）。将配好的污染土壤装入盆中（内口径25.4 cm，高19.7 cm），每盆装10 kg。将2017年购买的2年生苦楝实生苗栽植于塑料盆中，每盆移栽一株生长健康、大小均匀的苦楝，每种污染水平均设置5 盆重复，共15 盆，同时设置不掺铅锌矿渣的土壤栽植苦楝幼树作为对照（CK），5 盆重复。所有盆栽种植于2018年7月，进行相关指标测定。

表1 不同污染梯度铅锌矿渣污染土壤配方（质量比）Table 1 Mixed gradient of lead-zinc（Pb-Zn） residual tailing and soils (Mass ratio)

1.2 CO2 响应曲线的测定

2018年7—9月，采用美国Li-cor 6400（LICOR,Lincoln,USA）选择在完全晴朗天气的8:00—11:00 测定CO2响应曲线，测试之前，每盆供试苗木光诱导30 min，直到光合速率和气孔导度相对稳定后，利用光合作用仪6400 液化钢瓶控制参比室中CO2浓度依次为400、300、250、200、150、50、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600 μmol·mol-1，光强调制至1 000 μmol·m-2·s-1。每盆植物选择从植物顶端向下数第2、3 分支、生长状态良好、长势相同且朝向一致的3 片完全展开叶，避开选择老叶与嫩叶，每次测量时尽量选择每株植物上的同一叶片。

1.3 CO2 响应模型的拟合

1.3.1 直角双曲线模型

直角双曲线模型数学表达式[10]为：

式中：Pn为净光合速率；Ci为胞间CO2浓度；α为植物光合作用-CO2响应曲线（Pn-Ci曲线）在Ci=0 时的斜率，即初始斜率，也称初始羧化效率；Pnmax为最大净光合速率，即光合能力；Rp为光呼吸速率。

1.3.2 Michaelis-Menten 模型

M-M 模型的数学表达式[11]为：

式中：Pn、Ci、Pnmax和Rp的定义与（1）式相同，K为Michaelis-Menten 常数。

1.3.3 直角双曲线修正模型

直角双曲线修正模型的数学表达式[12]为：

式中：Pn、Ci、Pnmax、Rp和α与（1）式相同，b和c为系数（单位为μmol·m-2·s-1）。

1.3.4 FvCB 模型

FvCB 模型是1980年Farquhar 等提出的C3植物光合生化模型[13]，由3 个子模型构成，分别对应植物碳同化过程3 个限制阶段：Rubisco 酶活性限制、RuBP 再生速率限制和磷酸丙糖转运（TPU）速率限制阶段。模型中的参数Vcmax反映光合系统中Rubisco 酶最大羧化能力，Jmax反映光合电子传递链的最大电子传递能力，决定了RuBP 的再生能力，Tp反映磷酸丙糖的合成能力，gm反映CO2扩散阻力对光合作用的限制。

当光合作用受Rubisco 酶活性限制时，净光合速率（Ac）为：

式中：Vcmax为Rubisco 酶最大羧化速率；Kc为RuBP 酶羧化反应米氏常数（经验值为 27.238 Pa）；Ko为RuBP 酶氧化反应米氏常数（经验值为16 582 Pa）；O为氧气浓度（经验值为21 220 Pa）；Rd为光下暗呼吸速率。

当光合作用受RuBP 再生速率限制时，净光合速率（Aj）为：

式中：J为PS Ⅱ电子传递速率。

J与最大电子传递速率（Jmax）关系常用经验公式进行描述：

式中：θ为非直角双曲线函数曲率（经验值为1）；I2为PS Ⅱ吸收的有效光辐射。

式中：PAR 为光合有效辐射；α1为叶片的光吸收系数（经验值为0.85）；fⅡ为光能在光系统I（PSI）和光系统Ⅱ（PS Ⅱ）中分配的比例（经验值为0.5）；ΦPSⅡmax为最大PS Ⅱ光化学效率（经验值为1）。

当光合作用受磷酸丙糖转运速率限制时，净光合速率（Ap）为：

式中：Tp为磷酸丙糖的最大转运速率。

叶肉阻力（rm）为：

式中：Ci为胞间CO2浓度。

1.4 光合限制值的计算

目前的光合研究中将光合限制主要简化分为三大限制：气孔限制（SL）、叶肉导度限制（MCL）和生化限制（BL），根据Grassi 和Magnani 的光合限制值定量分析方法[19]，光合速率的变化主要受到gs、gm和Vcmax的影响：

而各部分限制值的计算公式分别为：

式中：gsc是气孔对CO2的导度，经验值为gs/1.6，∂Pn/∂CC用Pn/CC曲线CC浓度为50～100 μmol·mol-1时的曲线斜率表示。gtot为总导度，计算公式为：

光合参数的相对变化值计算公式为：

1.5 相对生长率的测定

根据干重数据，计算日相对生长率（Relative growth rate，RGR）：

式中：m2为收获时整株干质量，m1为处理前整株干质量，t为处理时间393 d。

1.6 数据统计分析

将测量数据分别以胞间CO2浓度（Ci）为横轴、净光合速率（Pn）为纵轴，绘制光合作用-CO2响应曲线（Pn-Ci曲线）。根据曲线实测点估计最大净光合速率（Pnmax），并利用线性回归的方法估算CO2饱和点（Cisat）和CO2补偿点（Cic），并将其作为实测参考值与不同模型的拟合值进行对比，分析各模型拟合效果。

CO2响应过程的模拟采用叶子飘的光合计算软件进行拟合分析，同时，将CO2响应曲线测量数据上传http://leafweb.ornl.gov/Pages/LeafWeb.aspx 自动分析系统进行FvCB 生化模型分析，光合生理生化参数的拟合参考Gu 的方法[20]。不同质量比铅锌矿渣处理下参数间的差异显著性采用Duncan’s 多重比较法，不同浓度不同处理时间的差异显著性采用双因素方差分析法进行数据分析和处理。对不同质量比铅锌矿渣处理下苦楝的相对生长速率（RGR）、最大羧化效率（Vcmax）、最大电子传递速率（Jmax）、磷酸丙糖转运速率（Tp）和叶肉导度（gm）进行PCA 分析。以上所有数据统计分析和绘图均在SPSS 20.0、Excel 2016、SigmaPlot 12.5 和Origin 9.1 中完成。

2 结果与分析

2.1 铅锌胁迫下3 种模型的适用性

由表2可知，在处理L1、L2、L3 和对照CK中，直角双曲线模型和M-M 模型拟合得到的最大净光合速率（Pnmax）分别为29.80、24.15、23.94 和34.95 μmol·m-2s-1，均显著高于实测值，在CK、L1和L2 中，CO2饱和点（Cisat）显著低于实测值，L3中CO2饱和点显著高于实测值，但是CO2补偿点（Cic）在所有处理中与实测值无显著差异。直角双曲线修正模型拟合得到的数据在最大净光合速率、CO2补偿点的拟合上与实测值无显著差异性，且拟合系数R2达到了0.99以上，表明拟合的可靠性很高。因此，采用直角双曲线修正模型对于拟合各浓度铅锌胁迫下苦楝光合作用-CO2响应曲线最为适宜。

表2 铅锌矿渣各质量比下光合作用-CO2响应参数值与模型拟合值†Table 2 CO2 parameters responses of different models under different Pb-Zn treatments

由图1可知，从曲线整体上看，直角双曲线模型与M-M 模型拟合曲线完全重合，在CK、L1、L2 和L3 的CO2响应曲线初始阶段（Ci＜600 μmol·mol-1），3 种模型都具有较好的拟合效果，拟合值与实测值无显著差异。但随着胞间CO2浓度的上升，净光合速率上升的幅度减小，模型拟合值与实测值之间开始出现明显的差异，直角双曲线修正模型的拟合效果相对直角双曲线模型和M-M 模型较好。在高浓度胞间CO2浓度下（Ci＞1 200 μmol·mol-1），净光合速率出现下降趋势，直角双曲线模型和M-M模型不能有效模拟此现象，但直角双曲线修正模型却能很好地拟合此现象，模型拟合值与实测值无显著差异。

图1 各质量比铅锌矿渣下3 种CO2 响应模型对光合速率-CO2 响应曲线的拟合Fig.1 Simulated A/Ci curves of three models under different Pb-Zn tailing treatments

2.2 铅锌胁迫下苦楝光合作用CO2 响应过程特征参数的响应

采用直角双曲线修正模型对苦楝CO2响应过程模拟，结果（表3）表明，在铅锌矿渣处理30 d 和90 d，苦楝初始羧化效率（CE0）、最大净光合速率（Pnmax）和光呼吸速率（Rp）均随着铅锌质量比的升高而显著降低。处理30 d 时，CO2饱和点（Cisat）和CO2补偿点（Cic）并无显著变化，但处理90 d，随着铅锌质量比的升高Cisat显著降低，Cic显著升高。在不同处理时间比较中发现，除CE0无显著变化，其余参数均表现为处理90 d 显著低于处理30 d。双因素方差分析表明，铅锌质量比和处理时间的交互效应对CE0和Rp有显著的影响，对Amax、Cisat和Cic无显著交互效应影响。

2.3 铅锌胁迫下苦楝叶片气体交换参数的响应

由表4可见，与CK 相比，L1、L2、L3 处理水平下苦楝叶片净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）均显著降低，表现为L3＜L2＜L1＜CK，而胞间CO2浓度（Ci）表现为显著升高。在不同处理时间比较中发现，L2、L3 水平下Pn、Gs、Tr在处理90 d 显著低于处理30 d，Ci处理90 d 显著高于处理30 d。双因素方差分析表明，处理水平与时间的交互效应对Pn、Gs和Tr有显著影响，对Ci无显著交互效应影响。

表3 铅锌矿渣处理下直角双曲线修正模型拟合参数†Table 3 Fitted parameters of modified rectangular hyperbolic model on day 30 and day 90 under different Pb-Zn tailing treatments

表4 铅锌矿渣处理下气体交换参数Table 4 The variation of gas exchange parameters on day 30 and day 90 under different lead-zinc tailing treatments

2.4 铅锌胁迫下苦楝叶片碳同化过程生化因子的响应

如图2所示，与CK 相比较，处理30 d 和90 d 下，苦楝叶片最大羧化效率（Vcmax）、最大电子传递速率（Jmax）、磷酸丙糖转运速率（Tp）和叶肉细胞导度（gm）均随着处理水平的升高显著下降。L1、L2、L3 不同水平处理90 d 的Vcmax、Jmax、Tp和gm均显著低于30 d。双因素方差分析表明，铅锌矿渣处理浓度、处理时间交互作用对苦楝Vcmax、Jmax、Tp和gm均有显著的影响。

2.5 铅锌胁迫下苦楝叶片光合限制

为评估铅锌胁迫下苦楝光合限制因素，运用光合限制值定量分析，结果（表5）表明，苦楝光合速率降低由生化限制（BL）、气孔限制（SL）和叶肉导度限制（MCL）共同导致。其中，苦楝光合下降的贡献率表现为BL＞SL＞MCL，BL贡献率大于40%，SL介于10%～20%之间，MCL小于10%。随着不同处理水平中土壤质量比的降低，BL、SL先上升到峰值后有所下降，MCL逐渐升高，但不会超过BL、SL。

2.6 铅锌胁迫下苦楝的相对生长速率

从图3可以看出，随着土壤中铅锌矿废渣质量比的增加，苦楝的相对生长率呈下降趋势，即L3＜L2＜L1＜CK，且差异性显著（P＜0.05）。与对照相比，L1 水平下苦楝的相对生长率下降了1.7%，L2 水平下下降了26.08%，L3 水平下下降了37.58%。

2.7 铅锌胁迫下苦楝叶片碳同化过程主成分分析

为更好地分析铅锌矿渣污染和碳同化过程生化因子以及苦楝叶片相对生长速率RGR 的关系，进行了主成分分析。从图4可以看出，根据提取的主成分个数一般要求累计方差贡献率达到85%的原则，共提取了2 个主成分，累计贡献率达96.3%。其中第1 主成分（PC1）的方差贡献率为 83.7%，第2 主成分（PC2）为12.6%。结果表明，相对生长速率RGR、Tp、Jmax、gm、Vcmax均分布在PC1 轴的正方向上，但gm、Vcmax还分布在PC2 轴的负方向上。可见，RGR 受碳同化过程中Tp、Jmax影响大于gm、Vcmax。从铅锌污染水平的点在影响因子箭头及其延长线的投影点可以看出，污染水平越高，与RGR、Tp、Jmax、gm、Vcmax呈现出负相关关系，说明随着污染水平的增高，苦楝的RGR和碳同化过程抑制更厉害。

图2 铅锌矿渣处理对生化参数的影响。Fig.2 The variation of biochemical parameters under different Pb-Zn tailing treatments

表5 不同铅锌处理水平和处理时间下苦楝光合限制率†Table 5 The percent of photosynthesis limitation parameters under different Pb-Zn tailing treatments

图3 不同铅锌处理水平苦楝相对生长速率Fig.3 The variations of relative growth rate under different Pb-Zn tailing treatments

图4 苦楝的相对生长速率与生化因子的主成分分析Fig.4 Principal component analysis for CO2 assimilation under different Pb-Zn tailing treatments

3 讨 论

3.1 铅锌胁迫下CO2 响应模型适用性

光合作用-CO2响应曲线的拟合是研究植物CO2响应过程的重要手段，直角双曲线模型和Michaelis-Menten 模型是处理分析光合作用-CO2响应曲线的常用方法，从理论上可以通过拟合CO2响应过程得出其特征参数，反映植物CO2的响应过程。但研究发现，植物的净光合速率不能随着CO2浓度的增长而无限增加，而上述两模型是没有极点的渐近线形式，因而其模拟的精确度受到极大地限制，无法准确拟合严重环境胁迫下植物的CO2响应数据[12]。本研究中，直角双曲线模型和Michaelis-Menten 模型对铅锌胁迫下苦楝CO2响应数据的模拟与实测值存在明显差异，具体表现在对CE0、Pnmax的严重高估和对Cisat的严重低估，这与前人在温度、干旱等胁迫下的研究相一致[14-15]。而叶子飘建立的直角双曲线修正模型由于对直角双曲线模型公式求一阶导数得出极值，克服了上述模型的局限性，可以准确地模拟苦楝CO2响应过程中的CO2抑制现象，各项特征参数与实测值十分接近，决定系数达到0.99 以上。因此，在模拟分析不同质量比铅锌矿渣污染土壤胁迫下苦楝CO2响应过程变化中，直角双曲线修正模型具有较高的准确性和适用性。

3.2 铅锌处理抑制苦楝CO2 响应过程

CO2响应曲线反映了植物光合速率随CO2浓度变化而变化的规律，可作为评价植物光合能力的重要依据。植物对CO2的响应过程会受到环境胁迫条件的干扰，并表现在植物内部一系列生理变化上[21]。如干旱、高温、强光及O3浓度升高等胁迫条件下，植物的光合潜能、CO2与光能利用能力、光合电子传递等均发生显著变化[22-23]。本研究应用直角双曲线修正模型对苦楝CO2响应过程拟合结果表明，铅锌矿渣的处理对苦楝CO2响应过程产生了显著的影响，矿渣处理水平越高，时间越久，参数变化幅度就越大，如CO2补偿点（Cic）的显著升高，最大净光合速率（Pnmax）、CO2饱和点（Cisat）、初始羧化效率（CE0）和光呼吸速率（Rp）的显著降低，这与之前的研究结果相一致，表明铅锌胁迫导致苦楝叶片CO2的利用能力下降，可有效利用PAR 范围变窄，同时初始羧化效率的下降可能是铅锌导致叶绿体CO2浓度下降，或Rubisco 酶活性下降。另外植物在胁迫环境下降低Cisat或提高Cic也是为保证植物光合作用能够运行[15]。

植物体90%～95%的干物质来自于光合器官的光合作用。本研究中，铅锌胁迫下植株生长受到抑制，这与其叶片光合能力的改变有关[4,6,18]。本研究发现铅锌胁迫下苦楝叶片净光合速率（Pn）显著降低，而且胞间CO2浓度（Ci）显著升高，说明非气孔限制是光合速率降低的主要原因[13]。

非气孔限制导致的光合速率降低与碳同化能力的障碍密切相关[24]，同时也包括叶肉层对CO2传输的阻碍作用[19,25]。首先碳同化能力主要受到酶活性变化的影响，在研究中发现，铅锌胁迫显著降低了Rubisco 酶羧化效率，这说明Rubisco 酶活性下降，同时Jmax下降有可能是光合酶活性（如景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶，果糖-1,6-二磷酸酶）受到铅锌的抑制或是电子传递链的受阻导致NADPH 和ATP 供应不充足[26]。其次CO2传导由气孔导度和叶肉导度决定，与前人研究相似，本研究中铅锌胁迫下苦楝叶片的Gs和gm均显著降低[25]，原因可能是铅锌导致叶绿体结构的改变以及水通道蛋白含量的降低[27]。上述分析表明铅锌胁迫下苦楝光合作用下降受到了酶失活和CO2传导受阻两方面的影响。

本研究中，铅锌矿渣处理水平越高，时间越久，苦楝光合作用的总限制（TL=BL+SL+MCL）显著增加，而且BL贡献率大于40%，SL介于10%～20%之间，MCL小于10%，表明铅锌胁迫下苦楝光合作用的降低主要归因于Rubsico 酶活性等生理生化过程下降造成碳同化能力受阻。但是SL和MCL对光合下降的作用也占有一定的比例，说明铅锌胁迫下不但空气中CO2进入叶片气孔量减少，而且CO2穿过细胞空隙和叶肉层最终到达叶绿体羧化位点的阻力增加，最终导致叶绿体内CO2浓度较低，无法保障 Rubisco 活化和功能的运转[28]。

此外，Sharkey 等研究表明，在CO2（Ci）浓度低时，光合速率下降主要是由于Rubisco 失活引起的，而随着Ci浓度升高达到高浓度时，光合速率下降主要是由于RuBP 再生过程受限引起的，而RuBP 再生过程与Jmax和Tp相关[29]。本研究中，铅锌矿渣胁迫下Vcmax、Jmax、Tp均显著下降，主成分分析结果也表明苦楝的相对生长速率受Jmax、Tp的影响更大，表明铅锌胁迫会抑制光合电子传递和光合磷酸化过程[30]，即铅锌胁迫对RuBP 再生过程影响更显著。由于碳同化过程是个复杂的过程，也易受到环境中各种因素的影响，因此重金属胁迫下对碳同化过程的机制的影响等生态问题均有待进一步的研究证实。

4 结 论

铅锌矿渣的处理对苦楝CO2响应过程产生了显著的影响，矿渣处理水平越高，时间越长，影响越严重。非气孔限制是导致苦楝叶片光合速率下降的主要原因，定量分析表明铅锌胁迫苦楝光合作用的降低主要归因于Rubisco 酶活性下降，特别是RuBP 再生过程受阻，造成碳同化过程出现障碍，气孔导度和叶肉导度对光合下降的也有一定的作用，最终苦楝的相对生长速率显著降低。本研究结果有望为重金属胁迫作用影响植物生长发育过程提供科学依据。