SIRT1/p53和SIRT1/FoxO3a信号通路在COPD患者Ⅱ型肺泡上皮细胞衰老中的作用研究

顾超 肖琴锋 应樱 陶峰 张齐 曹林峰

肺泡结构的破坏、肺组织降解以及气腔的扩大是导致慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）中气流受限重要原因［1］。目前为止，尚无足够有效的药物能够阻止COPD患者肺功能的下降［2］。修复已经损伤的肺组织，并且使丢失的肺泡组织再生是目前COPD治疗的关键及难点问题。Ⅱ型肺泡上皮细胞（AECⅡ）可以补充自身数量，也可分化为AECI，并合成以及分泌肺泡的表面活性物质，以及进一步维持肺泡内外液体的平衡等［3］。Sirtuins是Ⅲ型组蛋白的去乙酰化酶，可以对多种非组蛋白进行去乙酰化，并且在基因转录、能量代谢和细胞衰老中起重要作用［4］。本研究通过SIRT1/p53和SIRT1/FoxO3a信号通路检测其在COPD患者AECⅡ衰老中的相关作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料 （1）患者入组：2017年1月至2018年12月在本院行手术治疗的非小细胞肺癌且不伴COPD患者（A组）及COPD伴非小细胞肺癌（NSCLC）患者（B组）各20例。COPD伴NSCLC患者入选标准：符合COPD诊断标准，且第一秒用力呼气量占所有呼气量比值（FEV1/FVC）＜70%，50%≤一秒用力呼气容积（FEV1）＜80%的预计值；符合NSCLC诊断标准，TNM分期为Ⅰa-Ⅱb期；拟行肺癌手术治疗；2周内无COPD急性加重史；无支气管哮喘。NSCLC且不伴COPD患者入选标准：符合国际肺癌研究协会（IASLC）2009年NSCLC诊断标准，TNM分期为Ia-IIb期；无COPD、支气管哮喘等慢性气道疾病；拟行肺癌手术治疗。排除标准：存在除NSCLC以外其他恶性肿瘤史者；存在心、肝、脑等重要脏器功能不全的患者；有血液系统的相关疾病或者严重的凝血功能障碍患者；使用全身糖皮质激素者；使用化疗药物治疗者。所取标本选自距肺癌病灶手术切除边缘阴性5cm以外的肺组织，大小约1cm3，于-80℃保存。本项目由嘉兴市第一医院伦理委员会批准，所有患者均签定知情同意书。（2）主要试剂：兔抗人的FoxO3a抗体（购于美国的Cell Signaling Technology公司）；细胞衰老的β-半乳糖苷酶染色盒及兔抗人p53抗体（购于江苏碧云天公司）；TRIzol（购于美国的Invitrogen公司）；兔抗人SIRT1、SPA及SPC抗体及羊抗兔的IgG二抗（购自美国的Santa Cruz公司）；SIRT1去乙酰化酶检测试剂盒（美国Enzo Life Sciences公司）。

1.2 方法 （1）肺组织的病理学测定：两组患者的肺组织，于4%的甲醛中固定，脱蜡至水，后行HE染色，并按照本课题组前期的方法［5］，分析平均肺泡面积（MAA）和肺泡的平均内衬间隔（MLI）。（2）采用 Real-time PCR测 定 SIRT1、p53及 FoxO3a mRNA水平：收集两组患者肺组织，GAPDH作为内参；并以2-ΔΔCt来分析目的基因的相对表达差异。引物序列：SIRT1正义链5'-GCAGATTAGTAGGCGGCTTG-3'，反 义 链 5'-ACTTTCATCCTCCATGGGTTC-3'；p53正义 链5'-ACCACCATCCACTACAACTACAT-3'， 反 义链 5'-CAGGACAGGCACAAACACG-3'；FoxO3a正义 链5'-TGGCAAGCACAGAGTTGGATGA-3'， 反 义链 5'-TGGCGGGAGCGTGATGTTAT-3'。GAPDH 正义链5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3'，反义链5'-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3'。（3） 采 用Western blot检测SIRT1、p53及FoxO3a的蛋白表达：取新鲜的肺组织100g来用于提取总蛋白，取含有20μg蛋白的样品变性上样，后行电泳、转膜后予封闭，加入兔抗人SIRT1、p53及FoxO3a抗体孵育，之后加入山羊抗兔IgG孵育，凝胶成像系统扫描。（4）免疫组化法测定SPA及SPC蛋白的表达水平：肺组织切片，山羊血清予封闭，加入SPA或SPC抗体进行孵育，后加入抗兔IgG孵育，最后采用DAB显色以及苏木素复染后封片。（5）SA-β-gal活性测定：采用染色法测定患者的肺组织SA-β-gal的活性，按照试剂盒说明操作。（6）SIRT1去乙酰化酶活性测定：采用比色法检测两组患者的肺组织SIRT1去乙酰化酶活性，按照试剂盒说明操作。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件。计量资料以（）表示，采用方差分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织的病理学变化 两组患者肺组织HE染色，B组患者的肺组织中呈现肺气肿的表现：包括部分肺泡囊状的扩张，并且肺泡腔不规则，以及相同视野内的肺泡数目减少，肺泡间隔出现断裂，相邻肺泡融合，见图1。半定量分析显示，B组患者的肺组织中的MAA和MLI明显高于A组（P＜0.05），见表1。

表1 两组患者肺组织MLI及MAA变化（，n=20）

表1 两组患者肺组织MLI及MAA变化（，n=20）

注：与A组比较，*P＜0.05

组别 MLI（μm） MAA（μm2）A组 38.43±3.14 3212.68±126.36 B组 190.12±15.22* 21008.14±771.63*

图1 两组患者肺组织病理学变化（HE染色，×100）

2.2 SIRT1、p53及FoxO3a表达水平 Real-time PCR及 Western blot分 别 测 定 SIRT1、p53及 FoxO3a的mRNA及蛋白表达水平，结果显示，与A组比较，B组患者肺组织中SIRI1及FoxO3a的mRNA及蛋白表达显著降低（P＜0.05），而p53的mRNA及蛋白表达增加（P＜0.05），见图 2、3。

图2 两组患者肺组织SIRT1、p53及FoxO3a mRNA相对表达变化

图3 两组患者肺组织SIRT1、p53及FoxO3a 蛋白表达变化

2.3 SPA和SPC蛋白的表达水平 SPA及SPC蛋白阳性细胞呈现胞浆着黄棕色，位于肺泡角部的AECⅡ，与A组比较，B组患者肺组织中SPA及SPC阳性细胞明显减少，见图4、5。

2.4 SA-β-gal的活性变化 在肺组织中被染色成蓝色的细胞被认为是SA-β-gal阳性，即为衰老的细胞，主要位于肺组织肺泡的角部。与A组比较，B组患者中SA-β-gal阳性的细胞增加，见图6。

图4 两组患者肺组织SPA蛋白表达（×400）注：黑色箭头示SPA阳性细胞

图5 两组患者肺组织SPC蛋白表达（×400）注：黑色箭头示SPC阳性细胞

图6 两组患者肺组织SA-β-gal活性变化（×400）注：黑色箭头示SA-β-gal阳性细胞

2.5 SIRT1去乙酰化酶活性改变 采用比色法测定两组患者肺组织中SIRT1去乙酰化酶的活性，结果显示，与A组比较，B组患者肺组织中SIRT1去乙酰化酶活性明显降低（P＜0.05），见图 7。

图7 两组患者肺组织SIRT1去乙酰化酶活性比较（注：与A组比较，★P＜0．05）

3 讨论

目前为止，COPD被认为是全球死亡原因的第 4 位［2，6］，在我国 ＞40 岁患病率达到 8.2%［7］。肺泡结构的破坏及丢失和气腔扩大、肺弹性组织降解以及小气道阻塞是COPD特征的病理表现，并且也是肺功能下降关键性原因［2］。本研究中，COPD患者肺组织中的部分肺泡囊状扩张，肺泡腔的不规则，相同视野里的肺泡数目减少，肺泡间隔出现断裂，相邻的肺泡融合，符合COPD肺组织病理学表现。AECⅡ覆盖肺泡总面积的5%，虽然AECI数量是AECⅡ的一半，但覆盖了肺泡总面积95%。AECⅡ也能合成并分泌肺泡的表面活性等物质。AECⅡ对于维持肺泡正常结构及功能具有重要的意义。SPA及SPC是由AECⅡ特异性地分泌，其在减小肺泡表面的张力中起到重要的作用。AECⅡ是AECI的祖细胞，当AECⅡ严重受损时会导致肺泡结构受损和阻碍肺泡的修复［8-9］。在本研究中，COPD患者肺组织中的SPA以及SPC蛋白表达的水平明显降低，表明肺组织中AECⅡ存在受损情况。

相关研究显示：在COPD患者中的细胞衰老加速，进一步促进COPD的发生和发展［10］。因此，肺泡上皮细胞的异常表达可能与其过早衰老有关，AECⅡ衰老可能促进COPD发展，而深入研究AECⅡ衰老的调控机制可能为COPD治疗提供新靶点。SIRT1目前被认为是人类的长寿相关基因。SIRT1可以将H1、H3的组蛋白进行去乙酰化，还能将p53和叉头框蛋白O等非组蛋白去乙酰化，并在细胞衰老、基因转录及能量代谢中具有重要的作用［4］。吸烟人群外周肺组织中的细胞核SIRT1水平明显降低；并且SIRT1表达下调可以促进COPD患者内皮祖细胞出现衰老以及功能异常［11］。p53是最早发现的SIRT1非组蛋白底物，其可激活靶基因p21转录，将细胞周期阻滞在G1/S期，进而抑制细胞增殖以及进一步促进细胞衰老［12］。SIRT1则可使p53特异位点赖氨酸残基去乙酰化或作用于p53靶基因启动子，抑制p53活性、延缓细胞衰老。FoxO3a是insulin、IGF等信号通路关键性下游调节靶点；在insulin或IGF刺激下，FoxO3a发生磷酸化，SIRT1与其形成蛋白复合物，使其去乙酰化、转位出核，抑制p27等基因表达、促进细胞存活［13-14］。COPD患者气道组织中核内FoxO3a的表达亦与其细胞衰老水平一致［15］。SA-β-gal是细胞衰老的重要相关标记［16］。在本研究中，B组患者肺组织中SIRI1及FoxO3a mRNA及蛋白表达明显低于A组，而p53 mRNA及蛋白表达高于A组；并且肺组织中的SA-β-gal阳性的细胞显著增加，SIRT1去乙酰化酶活性明显降低。

综上所述，SIRT1/p53和SIRT1/FoxO3a信号通路通过下调SIRT1和FoxO3a的表达及上调p53的表达来调控COPD患者Ⅱ型肺泡上皮细胞的衰老。但是，FoxO3a与p53信号通路之间的交汇对话机制仍需进一步研究。