化学发光法在丙烯酰胺测定中的应用探讨

吴升红

(安徽粮食工程职业学院，安徽 合肥 230011)

丙烯酰胺，简称AM，是一种小分子白色晶体，被广泛应用于纺织、污水处理及净化、冶金化工等多个领域，复合体的丙烯酰胺并没有毒性，但是单体形式存在的丙烯酰胺具有很强的毒性.众多科学家通过大量的动物实验证实丙烯酰胺具有神经毒性、遗传毒性以及生殖等毒性，此外还会引起基因突变以及造成染色体异常，诱发癌症，国际癌症机构将其列入到2A类致癌物质[1].其可通过口腔、皮肤以及呼吸道等多种途径进入人体中从而对生命安全造成威胁，因此检测丙烯酰胺是非常必要的.尤其食物是丙烯酰胺的主要来源，寻求有效的快捷简便且成本低廉的丙烯酰胺检测分析方法极为重要，对此采用化学发光法对食品中的丙烯酰胺物质进行测定实验，结果显示鲁米诺—过氧化氢化流动注射化学发光分析法是测定丙烯酰胺的有效方法，能有助于防范食品安全问题.

1 食物中丙烯酰胺测定研究进展

瑞典食品局在2002年发表声明指出高温油炸后的淀粉类食物中的丙烯酰胺含量偏高，美国、英国等国家先后报道证实了这一结果.FAO和WHO等组织机构先后召开了会议对食品中丙烯酰胺的安全性进行了讨论并进行了危险性评估.丙烯酰胺早已成为了食品安全领域研究的热点话题，众多科学家及研究学者纷纷展开研究，探寻有效的丙烯酰胺测定分析方法.

李河山(2017)[2]采用了固相萃取-高效液相色谱分析方法对烹饪食物中的丙烯酰胺含量进行检测，结果显示在0.05～5.00 μg/mL浓度范围内有着良好线性关系，RSD在1.8%～3.2%范围内，李河山指出该方法是高效快速的检测分析方法；肖晓茹等人(2018)[3]采用加压毛细管电色谱法对辣条中丙烯酰胺进行分离检测分析，实验结果显示能起到良好的分离作用，在2.0～32 μg/mL内具有良好的线性关系，相关系数高达99.9%，研究表明该分析方法能有效测定丙烯酰胺含量；Pedreschi(2010)通过近红外光谱与视觉反射成像结合的方式形成了在线检测模型，经过研究发现预测值的误差仅为266 μg/kg，与实际检测值的线性相关性达到了83%，指出该方法能实时对样品中的丙烯酰胺进行分离[4]；Ayvaz(2015)利用便携式红外光谱仪对辣条中丙烯酰胺进行检测分析有着良好的线性关系，标准误差小于100 μg /kg[5].虽红外光谱分析法具有高效、在线分析等特点，但是受到模型和参数的影响会造成检测的不稳定性、灵敏度较低.

目前常用的丙烯酰胺包括色谱法、光谱法等方面，在化学发光法的检测分析上，张罗一览(2015)利用丙烯酰胺对高锰酸钾-甲醛-抗坏血酸体系的抑制作用建立了运用化学发光法快速检测水中丙烯酰胺的方法；高向阳与赵琛等人(2014)利用鲁米诺-高锰酸钾化学发光体系[6]，采用化学发光法对辣条等油炸食品的丙烯酰胺含量进行测定，总体而言用化学发光法对食品中的丙烯酰胺进行检测分析的研究并不多见.化学发光检测分析方法具有简便、分析时间短、成本低廉等特点，将其应用到食物的丙烯酰胺检测中具有很强的可行性.

2 化学发光法原理及特点

化学发光法，简称CL法，其是依据在某个时刻下化学发光所产生的发光强度或者发光总量进行组分含量测定的一种分析方法.化学发光反应指的是在进行化学反应的过程中，反应的中间体或产物的分子或原子吸收了反应过程中释放的化学能而处于电子激发态，在回到基态的同时伴随发出光辐射的一种现象[7].化学发光反应机制如下所示：

A+B→C*+D(激发)
C*→C+hv(发光)

化学发光反应需要满足的能在反应过程中提供充足的激发能量、能产生激发态分子产物以及激发态分子产物能释放出光子或者将能量转移至其他的分子使其进入激发态发光并释放出光子这三个必备条件.目前常见化学发光体系包括高锰酸钾、过氧草酸酯类、酰肼类以及吖啶酯类等多种类型[8].为提高化学发光法的检测分析效率与灵敏度，近年来化学发光法与流动注射技术相结合已经成为趋势，弥补了传统化学发光法的可控性差等缺点.整体而言流动注射化学发光法具有操作方法简单、灵敏度高以及较宽线性范围等诸多特点，是一种高效、便捷的检测分析方法.

3 化学发光法测定食物中的丙烯酰胺

3.1 实验设计

3.1.1 材料与试剂

本次实验是对油炸类食物中的丙烯酰胺进行测定分析，对此在本地超市采购辣条、江米条作为实验材料.本次实验所需的试剂包括鲁米诺(北京化工厂)、过氧化氢(天津市恒兴化学试剂制造有限公司，30 g/100 mL)、丙烯酰胺标准品(国药集团)、氢氧化钾(国药集团)等，其中除了丙烯酰胺标准品与鲁米诺外，其它试剂均为分析纯.实验中所采用的水为二次去离子蒸馏水.

3.1.2 设备与仪器

本次实验主要采用主要仪器与设备包括由西安瑞迈生产的IFFM-D型流动注射化学发光分析仪和IFFS-A型多功能化学发光检测器、BS210S型电子分析天平(北京塞多利斯天平有限公司)、离心机(德国 Sigma)、旋涡混合仪(上海达姆)以及电热恒温鼓风干燥箱本次(浙江海得)等.

3.1.3 实验溶液配制

实验溶液主要包括丙烯酰胺标准溶液以及鲁米诺溶液等，具体的配置方法如下：

丙烯酰胺标准溶液：将在55 ℃下烘干的0.0355 g丙烯酰胺标准品置于烧杯中，采用去离子蒸馏水溶解于50 mL的容量瓶中作为储备液.使用时用去离子蒸馏水逐级稀释至所需的标准溶液浓度；

鲁米诺溶液(2×10-2mol/L)：用天平准确称取3.5432 g的鲁米诺，并用浓度为0.10 mol/L的氢氧化钾进行溶解于1 L的棕色容量瓶中作为储备液，遮光常温保存14 d.

鲁米诺溶液(4×10-4mol/L)：用吸量管吸取4 mL的鲁米诺储备液于容量瓶中，利用0.10 mol/L浓度的氢氧化钾调节pH值到定容的200 mL刻度即可.

过氧化氢溶液(0.5 mol/L)：取10.2 mL的过氧化氢定容于棕色的200 mL的容量瓶.

Carrez Ⅰ溶液：将15 g的亚铁氰化钾与100 mL去离子蒸馏水混合；

Carrez Ⅱ溶液：将30 g 的硫酸锌与100 mL去离子蒸馏水混合.

3.1.4 样品预处理

将样品粉碎后放入干燥箱内烘干至恒量，称取5 g置于离心管内，依次加入10 mL的去离子蒸馏水、1 mLCarrez Ⅰ溶液、1 mLCarrez Ⅱ溶液和10 mL的正己烷后放置于震荡仪中震荡2 min，然后再放置在离心机上离心15 min后去除正己烷层，再使用0.22 μm滤膜过滤水相.将2 mL滤液用0.1 mol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液定容至25 mL.本次流动注射化学发光实验测定方法流程如图1所示：

图1 流动注射化学发光实验测定方法流程

4 结果与讨论

将光电倍增管的负高压设定为400 V，增益为1时，对化学发光仪器的参数进行优化.化学发光反应除了与发光体系的类型相关外，与反应介质的pH值、浓度等因素也是紧密相连的.为促使化学发光强度达到最大，需寻找最佳的化学发光反应介质.碱性环境下鲁米诺溶液的发光性能较好[9]，对此设定鲁米诺、过氧化氢与丙烯酰胺标准溶液的浓度分别为6×10-4mol/L、0.5mol/L和1×10-8mol/L条件，使用氢氧化钾来调节鲁米诺溶液的pH值，以0.5个pH值为变化测定，测定结果如图2所示.从图2中可以看出在pH=12.5时相对发光强度值达到最大.

图2 PH值与相对发光强度的关系 图3 鲁米诺溶液浓度与相对发光强度的关系

在鲁米诺溶液pH为12.5条件下，氧化氢与丙烯酰胺标准溶液的浓度与上次浓度一样，考察不同鲁米诺浓度下相对发光强度值的变化，包括1×10-5mol/L、3×10-5mol/L、5×10-5mol/L、7×10-5mol/L、1×10-4mol/L、3×10-4mol/L、4×10-4mol/L、5×10-4mol/L、7×10-4mol/L、1×10-3mol/L浓度，结果如图3.从图3可以明显得到在鲁米诺溶液浓度为4×10-4mol/L时发光强度达到最大.在pH=12.5，鲁米诺浓度为4×10-4mol/L，丙烯酰胺标准溶液为1×10-8mol/L条件下，分别考察不同浓度下过氧化氢浓度对相对发光强度产生的影响，如图4所示，当过氧化氢的浓度为0.5 mol/L时相对化学发光值达到最大.

图4 过氯化氢浓度与相对化学发光值关系

综合化学反应介质选择实验来看，应选择pH=12.5、4×10-4mol/L浓度的鲁米诺溶液，选择0.5 mol/L的过氧化氢溶液才能促使化学发光效果达到最佳.

根据所设定的实验参数，在pH=12.5、4×10-4mol/L浓度的鲁米诺溶液和0.5mol/L的过氧化氢溶液的反应介质条件下对样品进行测定实验，丙烯酰胺浓度与相对化学发光的关系，实验结果显示，丙烯酰胺浓度在1×10-6～1×10-3mol/L范围内有着良好的线性关系，相关度R2超过0.99，相关性系数r为0.993.在同等实验条件下，对丙烯酰胺标准溶液(1×10-9mol/L)进行11次平行测定，通过3S/N方式计算出得到的方法检出限为3.99×10-8mol/L.

在最优实验条件环境下，进行了干扰实验，当可容许的相对误差在±5%范围内时，100倍的K+、Na+、Cl-和50倍的Ca2+、Mg2+、Zn2+、Al3+、Fe3+等离子，以及3倍的酒石酸、柠檬酸、葡萄糖进行抗干扰的实验.经过实验测试表明，这些离子对于丙烯酰胺检测没有影响.表明化学发光检测分析方法具有较高的选择性及抗干扰能力.对辣条、江米条样品待测液进行3次平行测定.进行加标回收实验，同样进行3次平行测定，取平均值作为实验结果，如下表1所示.

表1 加标回收实验结果

通过表1可以看出江米条A、B样品以及辣条A中并未检测出丙烯酰胺，辣条B样品中检测出1.13×10-6mol/L的丙烯酰胺，加标回收率在91.5%～98.6%范围内.另外，对辣条B进行5次平行测定，测定的平均值为2.51 μg/g，相对标准偏差RSD仅为1.4%.

5 结 论

构建鲁米诺—过氧化氢化学发光体系，采用流体注射化学发光法对辣条、江米条食物中多含的丙烯酰胺进行检测实验，实验结果显示在1×10-6～1×10-3mol/L丙烯酰胺浓度范围内存在良好的线性关系，相关性系数为0.993，检出限为3.99×10-8mol/L，加标回收率在91.5%～98.6%范围内，RSD为1.4%.测定实验结果显示该方法在检测油炸食品所含丙烯酰胺效果较为理想，检测灵敏度高、成本低廉等优点，值得被广泛应用于测定食物中的丙烯酰胺含量.