高糖环境下大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化和线粒体自噬相关性的研究*

关淼升 王潇宇 刘 琳 傅 博 王田田 沈婉君 李鸿波

糖尿病是一种由多种病因引起的代谢紊乱，其特征是由于胰岛素分泌缺陷或者胰岛素功能异常所引起的慢性的高血糖和糖类、脂肪和蛋白质代谢紊乱[1]。先前研究表明，骨髓间充质干细胞对于维持骨形成和再吸收之间的平衡具有重要意义[2]。糖尿病会抑制成骨愈合过程中骨髓间充质干细胞的迁移、增殖和分化成成骨细胞的能力。高血糖环境下rBMSCs 的增殖、成骨分化、ALP 活性、胶原分泌功能受到抑制；RUNX2、BMP- 2、骨钙蛋白、骨桥蛋白基因表达下降；BMP 信号通路、PI3K/AKT 通路抑制[3,4]。高糖环境下rBMSCs 功能减弱，是糖尿病患者骨质疏松、牙槽骨丧失、种植修复成功率低的重要原因,但是其机制仍不清楚。

近年来越来越多的研究发现[5,6]，线粒体自噬现象和rBMSCs 的成骨分化相关。线粒体自噬，即线粒体的自噬，一种特殊形式的自噬，通过这种自噬将受损或衰老的线粒体或线粒体的一部分向溶酶体递送以进行降解的现象，是一种线粒体的质量控制形式[7]。线粒体自噬被认为是一种细胞存活机制，负责清除受损，多余或老化的线粒体[8]。尽管如此，还没有线粒体自噬在高糖环境中的对rBMSCs 成骨分化作用的相关报道。为此，本研究的目的在于探讨rBMSCs 在高糖环境下线粒体自噬和成骨分化的相关性。

1. 材料和方法

1.1 材料 SD 大鼠(2 周龄，25～35g，SPF 级)；rBMSCs 完全培养基(L- DMEM(Corning)+10%FBS(Corning)+1%青链霉素(Sigma)+1%谷氨酰胺(Sigma)；rBMSCs 分别进行成骨诱导(L- DMEM 培养基中含有10%FBS、L- 抗坏血酸50mg/ L(Sigma)、β- 甘油磷酸钠10mmol/ L(Sigma)、地塞米松10-7mol/ L(Sigma)，1%青链霉素)；成脂诱导培养基(高糖DMEM 培养基10%FBS，1μM 地塞米松，0.5mM IBMX(Sigma)，10μg/ μl 胰岛素(Invitrogen)和100μM 吲 哚 美 辛(Sigma)；抗LC3 抗 体(Abcam)，抗ALP 抗体(Abcam)，OPN(Abcam)。

1.2 SD 大鼠rBMSCs 的分离培养和鉴定 取2 周龄SPF 级SD 大鼠全骨髓培养法分离、培养细胞[9]。具体方法为：SPF 级SD 大鼠脱颈处死，75%乙醇浸泡5～10min，把股骨、胫骨、肱骨解剖分离出来、放入盛有预冷的PBS 的培养皿中(培养皿放在冰袋上保持低温)，用直镊、弯镊、眼科剪配合剥离掉骨头上面附着的肌肉筋膜(不要蛮力弄断骨骺端)。用剪刀剪断骨骺端使骨髓腔暴露出来，用1mL 注射器吸取BMSC 完全培养基，把针头插进髓腔把骨髓冲出来红色的絮状物，冲进另一个新的盛有BMSC 完全培养基的培养皿中。冲至颜色发白是即髓腔被冲干净。把冲出的骨髓悬液收集到离心管中，轻轻吹打均匀，到红色絮状看不见。吹打后的悬液用滤网过滤去除混入的细微的肌肉、筋膜组织，将过滤后的液体接种在T75 的塑料培养瓶中，一只大鼠的所有细胞可以接1～2 个培养瓶，每个培养皿大概需要15mL 的培养基。首次分离细胞做计为day0。每隔两天换液，换的时候就把所有培养基吸掉，加新的培养液就行，大概2～3d就能看到瓶底一团一团的小集落，细胞是小短梭形的，之后集落就越来越大，集落之间有时候还会有接触。大概7day 细胞可以长至80%～90%融合度，此时可以传代。每两天用完全培养基换液一次，待细胞长满时传代，待细胞传至P3 代时，光学显微镜下拍照。流式细胞技术进行CD29+、CD73+、CD90+和CD105+、CD34+和CD31+标记物表征。取P3 代rBMSCs 分别进行成骨诱导14 天后1%茜素红染色和成脂诱导14 天后油红O 染色，并在光学显微镜下拍照。

1.3 rBMSCs 在高糖环境下细胞增殖及成骨分化实验 将P3 代rBMSCs 以1000 个/ 孔的密度接种在96 孔板，待细胞贴壁后更换不同葡萄糖浓度的完全培养基(5.5mM，15mM，30mM，40mM)培养7 天，每种浓度设3 个副孔，分别在第1 天、第3 天、第5 天和第7 天，应用Celigo 全视野细胞扫描分析仪观察细胞融合情况，根据细胞融合度绘制细胞增殖曲线。将P3 代细胞以5×104/ mL 的密度接种在12 孔板内，待细胞贴壁后换用5.5mM葡萄糖浓度、30mM 葡萄浓度和30mM 甘露醇浓度的成骨诱导培养基培养，每隔2 天换液，诱导14 天后1%茜素红染色，数码相机拍照，Image J软件分析矿化染色产物百分比。

BGM是美国NCEP(the National Centers for Environmental Prediction)集合预报系统采用的一种初值扰动方法。传统方法主要包含以下几个步骤(Toth and Kalnay,1997):

1.5 统计方法 计量资料用均数±标准差表示，应用SPSS17.0 软件进行统计学分析，SNK 检验用于多个组均数的两两比较，若P＜0.05 认为有统计学差异。

(5) 从耗能能力上来看，角钢钢肢厚度对耗能影响并不大，梁腹开孔控制距离后对耗散影响也不大，而经过较大转角实验的节点替换角钢会明显降低节点能力耗散系数。当破坏发生在梁端时，节点耗能能力主要取决于梁的抗弯能力及翼缘抗拉抗压能力。

2.1 SD 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定 本研究中分离提取的SD 大鼠rBMSCs 贴壁生长，细胞形态呈成纤维样，漩涡样、集落样生长。光镜下的细胞形态饱满，细胞轮廓及细胞核清晰，表现出较强的活性(图1)。流式细胞术结果显示(图2)，细胞的分子表型中CD29+(89.8%)、CD73+(86.1%)、CD90+(86.6%)和CD105+(80.2%)表达成阳性，CD34+(8.86%)和CD31+(6.71%)表达成阴性。成骨诱导14 天，茜素红染色光镜下可见大量红色矿化结节；成脂诱导14 天油红O 染色，光镜下可见大量脂滴形成(图3)。本组分离的细胞符合国际细胞治疗协会[10]关于rBMSCs 表面标志物的标准且具有成骨及成脂分化的潜能，表明分离的rBMSCs 具有间充质干细胞的特性。

1.4 rBMSCs 成骨分化和线粒体自噬相关性的研究

1.4.3 RT- PCR 检测成骨相关蛋白和线粒体自噬相关基因的表达 按照2.4.1 分组的方法，将rBMSCs 以5×104个/ mL 的密度接种在6 孔板内，成骨诱导7 天应用RT- PCR 检测成骨相关基因和线粒体自噬相关基因的表达情况。基因包括LC3I、LC3II、ALP 和OPN。18s 作管家基因。通过NCBI在线引物设计系统设计目的基因引物(表1)。使用PrimeScript RT 试剂盒分离，纯化和逆转录各组rBMSCs 的总RNA。在CFX96 实时PCR 系统(BioRad，美国)中一式三份进行实验。使用2- ΔΔCt方法计算结果，并显示为相对于对照(5.5mM 组)的倍数调节。

表1 引物序列设计

1.4.4 激光共聚焦显微镜观察Mitotraker 和LC3 共定位情况 将P3 代rBMSCs 以1.5×104/ mL的密度接种在放置有圆形玻璃盖玻片的24 孔板上，24h 后细胞爬片，更换成不同葡萄糖浓度骨诱导培养基(分别为5.5mM 低糖组、30mM 高糖组和甘露醇等渗对照组)，培养7d，待细胞融合至60%～70%时，在含有500 nM MitoTracker R○Deep Red FM的培养基中，37℃下孵育30 min，在- 20℃下将细胞放入冰冷的100%甲醇中固定15 min，随后用PBS漂洗3 次，持续5min，然后用0.3%Triton X- 100透化10min。然后，用PBS 中的2.5%牛血清白蛋白进行封闭30min。随后，将细胞与针对LC3B 的一抗在室温下孵育2h。洗涤后，将它们在室温下与Cy3- 缀合的抗兔二抗(碧云天)一起温育1h，洗涤，固定在载玻片上并用共聚焦显微镜检查。Image J软件分析mito- tracker 和LC3 共定位情况，通过Image J 软件分析用皮尔森相关系数——Pearson’s correlation coefficient(PCC)进行定量。

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1.4.1 分组 成骨诱导培养基成骨诱导7 天，按照成骨培养基中糖浓度的不同分别分为5.5mM葡萄糖浓度组、30mM 葡萄浓度组和30mM 甘露醇组。

2. 结果

1.4.2 Western Blot 检测成骨相关蛋白和线粒体自噬相关蛋白的表达 Western Blot 检测线粒体自噬蛋白LC3 和成骨相关蛋白ALP、OPN 的表达情况。按照2.4.1 分组的方法，将rBMSCs 以5×104个/ mL 的密度接种在6 孔板内，成骨诱导7 天后培养的细胞经过裂解后提取蛋白质，上样到聚丙烯酰胺凝胶板上进行电泳，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。用2%的10×CHSEIN 封闭，并与抗LC3、抗ALP 和抗OPN 孵育。使用辣根过氧化物酶缀合的二抗和Bio- Rad 增强化学发光成像仪检测信号。将蛋白质表达水平相对于β- actin 标准化。Image J 软件对蛋白印记条带进行荧光密度半定量分析。

图1 倒置显微镜下观察P3 代细胞形态

图2 流式细胞鉴定细胞表面分子标志物

图3 rBMSCs 成骨、成脂分化潜能

2.6.1 主成分因子特征值、方差贡献率分析 采用SPSS 17.0软件进行主成分因子分析，其特征值和方差贡献率见表6。由表6可知，以特征值＞1为标准，得到前2个主成分因子的特征值分别为8.237、1.935，方差贡献率分别为75.206%、17.591%，累积方差贡献率为92.797%＞85%。故采用前2个主成分因子为指标对10批药材样品进行评价，详见表7。由表7可知，主成分因子1可反映成分1、2、3、5、6、8、9、10、11的信息，主成分因子2可反映成分4、6、7的信息。

2.2 高糖环境下rBMSCs 增殖情况 应用Celigo 全视野细胞扫描分析仪对细胞的增殖分化能力进行评估，其采用高分辨率全孔成像技术能够定量分析全孔细胞的融合度。本研究发现：5.5mM葡萄糖浓度组下细胞呈正常的增殖趋势；20mM 组细胞的增殖低糖组相比呈现出一定的影响(图4)，但是差异程度不显著(P＞0.05)(图5)；30mM 组细胞融合度融合度在第1 天开始就显著低于低糖组(P＜0.001)，且这种抑制显示出“逐步”或“浓度-时间相关”效应。40mM 组细胞增殖的和低糖组相比，细胞融合度的差异现象更为显著。

图4 成全视野细胞成像仪观察细胞融合度

图5 细胞增殖曲线

2.3 高糖环境对rBMSCs 的成骨分化的影响从茜素红染色大体照可以定性观察到，5.5mM 浓度葡萄糖组的茜素红染色结节明显多于30mM 浓度葡萄糖组，和30mM 甘露醇对照组相比无显著差异。Image J 软件对矿化结节面积百分比进行半定量分析显示，5.5mM 浓度葡萄糖成骨诱导组显著多于30mM 浓度葡萄糖成骨诱导组(P＜0.01)。(图6)

2.4 成骨相关蛋白和线粒体自噬相关蛋白表达情况 30mM 组的ALP 表达显著低于5.5mM 葡萄糖组(P＜0.01), OPN 的表达也呈现显著差异(P＜0.05)。LC3 II 和LC3 I 为线粒体自噬相关蛋白，可以发现LC3 II/ LC3 I 表达情况在5.5mM 组和30mM 高糖组直接存在显著差异(P＜0.01)，同时LC3 II 的表达情况在两组间也存在差异(P＜0.05)。(图7)

图6 高糖环境对rBMSCs的成骨分化的影响

图7 Western Blot 实验检测Day7 时成骨相关蛋白和线粒体相关蛋白的表达情况

船舶总长主要取决于航道曲率半径的限制，目前尚无理论计算公式，通常依据经验或实船试验来确定。根据《内河通航标准》的规定，航道曲率半径R≥4L(L为船舶总长)[7]，计算得到京杭运河船舶的最大船长允许值见表3。

2.5 RT- PCR 检测高糖环境下成骨相关基因和线粒体自噬相关基因表达 RT- PCR 结果(图8)显示，30mM 组的LC3 II 表达较5.5mM 组和甘露醇组略有降低，并无明显统计学差异，而LC3 II与LC3 I 的相对比值在30mM 高糖组有明显下降(P＜0.05)。与此同时，ALP 和OPN 在30mM 组的表达水平均发生较为明显的降低(P＜0.001)。

图8 RT- PCR 实验检测Day7 时成骨相关基因和线粒体相关基因

2.6 激光共聚焦显微镜观察Mitotraker 和LC3共定位情况 激光共聚焦显微镜观察显示，线粒体标记物Mitotracker 显示红色荧光，LC3 自噬溶酶体标记物显示绿色荧光。两种荧光的共定位情况结果可见，5.5mM 浓度葡萄糖的成骨培养基中PCC=0.52；30mM 浓度葡萄糖的成骨培养基中PCC=0.26；30mM 浓度的甘露醇成骨培养基PCC=0.46。(图9)

3. 讨论

图9 激光共聚焦显微镜观察Mitotraker 和LC3 共定位情况(400×)

rBMSCs 作为最早分离出来的间充质干细胞，被广泛的用于科学研究，其具有典型的多潜能分化特性[11]。在本研究中，应用Celigo 全视野细胞扫描分析仪对细胞的增殖分化能力进行评估，其采用高分辨率全孔成像技术能够定量分析全孔细胞，避免细分布不均带来的误差，可以连续观察孔内细胞的增殖情况。基于细胞的形态学特点，本研究采用细胞的融合度来评估细胞的增殖情况，并根据不同时间点细胞的融合程度绘制细胞增殖曲线。通过增殖曲线图可以观察到，在低浓度(5.5mM、15mM)葡萄糖MSC 培养基中，细胞的增殖未受影响，成正常的S 型增殖曲线；而在高浓度(30mM、40mM)时细胞的增殖受到明显的抑制。Zhang 等的研究结果[12]也发现高糖环境能够抑制牙周膜干细胞的增殖，其抑制浓度在25mM 以上，与本研究发现的结果类似。考虑到大量研究细胞高糖环境的文献采用30mM 这一浓度[13-15]，并结合细胞增殖实验结果，本研究在后续成骨诱导中的高糖环境采用30mM 的葡萄糖浓度。

为了探究高糖环境对rBMSCs 的成骨分化影响，研究中通过茜素红染色进行定性及半定量评估。分别将5.5mM 作为低糖对照组、30mM 葡萄糖作为高糖组以及30mM 的甘露醇作为等渗对照组，在不同的成骨诱导培养基中诱导14 天。茜素红S 染色是在成骨分化过程中鉴定钙沉积物的常用技术。钙在螯合过程中形成茜素红S- 钙络合物。通过比较染色面积所占百分比，可以发现，高糖环境下rBMSCs 的成骨分化和低糖对照组相比受到显著抑制(P＜0.01)，而甘露醇等渗干预并未对成骨分化造成显著影响。

全域旅游发展的新观察和新思考 主持人：厉新建 全域旅游发展的若干思考 王昆欣 / 大力发展全域旅游，满足人民对美好旅居生活的需求 李柏文 / 如何看待和发展“全域旅游” 宋 瑞 / 全域旅游战略的需求侧视角 厉新建 贾 然 傅林峰 01（72）

哺乳动物微管相关蛋白- 1 轻链3(microtubule- associated protein- 1 light chain3，LC3)是自噬体的伸长- 闭合机制的一部分。其以两种形式存在，其中一种形式不和脂类结合，广泛分布在细胞质中，称为LC3I；脂质磷脂酰乙醇胺结合的形式，并与成熟自噬体的两个膜结合，称为LC3II[16]。在自噬体形成过程中，同型LC3- I 转化为的LC3-II，因此可以作为自噬体数量和自噬的诱导的标志物[17]。在研究中评估了自噬相关蛋白LC3 的表达，发现在高糖环境中LC3II 以及LC3II/ LC3I 的表达程度降低。同时，成骨相关蛋白ALP、OPN 的表达也呈现这一趋势。线粒体自噬作为一种线粒体的质量控制形式特殊形式，被认为是一种重要的细胞存活机制，负责清除受损，多余或老化的线粒体。Nuschke 等人[18]的研究发现II 型轻链3(LC3- II)蛋白(活性自噬体的标记物)的积累与成骨分化相关，表明在刺激分化时自噬的激活处于激活状态。Nollet 等研究[19]发现，在成骨细胞特异性、自噬缺陷小鼠中敲除用自噬必需基因后发现自噬和成骨细胞的矿化和骨稳态相关。Pei 等的研究[20]也发现，在成骨谱系定型的间充质干细胞中线粒体内无定形磷酸钙积累引发的线粒体自噬通过BMP/ Smad 信号传导途径参与生物矿化过程。类似地，本研究的结果可能提示自噬和rBMSCs 的成骨分化成正相关，高糖环境能够抑制自噬和成骨分化。

为了更进一步地评估高糖环境对线粒体自噬的影响，本研究通过免疫荧光共定位来评估线粒体的自噬能力。线粒体自噬的显著特征是线粒体被双层膜结构的囊泡或自噬体包裹。因为自噬体最终需要与溶酶体融合，所以线粒体自噬可以通过线粒体与溶酶体标记物的共定位进行评估。通过分析共定位信号作为线粒体自噬的指示，可以量化含有线粒体的自噬体与溶酶体结构的成功融合。当通过多通道荧光显微镜观察相同的样本区域时，不同的荧光通道会激发出各自标记的抗原产生不同颜色的像素信号，而共定位就可以解释为在相同像素位置处信号的存在的现象[21]。因此为了尽可能的减少背景对于图像质量的干扰，研究中选择通过激光共聚焦显微镜对细胞样本进行观察。在定位分析中选择观察线粒体标记物Mito- tracker 和Cy3 缀合的自噬体标记物LC3 的荧光信号表达，并通过皮尔森相关系数进行定量分析。结果可见5.5mM 浓度葡萄糖组的共定位情况(PCC=0.52)优于30mM 浓度葡萄糖组的共定位情况(PCC=0.26)，而30mM 甘露醇等渗对照组(PCC=0.46)和5.5mM 组差异不大。上述结果表明，高糖环境可能会抑制rBMSCs 在成骨过程中的线粒体自噬现象，进一步证实了之前Western Blot 和RT- PCR 结果。