茵陈四苓颗粒对胆汁淤积性肝炎大鼠肝功能损害的改善作用及其机制研究*

杨 涓

胆汁淤积性肝炎(cholestasis hepatitis，CH)又称淤胆型肝炎或胆小管型肝炎，是各种原因引起的胆汁形成、分泌和(或)胆汁排泄异常而导致的肝脏病变，占黄疸型肝炎的2%～8%[1，2]。临床治疗CH主要以糖皮质激素、甘草酸制剂、熊去氧胆酸和S-腺苷-L-蛋氨酸等药物为主[32]，但由于CH的病因多样，药物治疗往往疗效有限。近年来，多项研究证实传统中医药对CH具有较好的治疗效果。《伤寒论》中的茵陈蒿汤为疏肝利胆退黄法治疗黄疸的基本方，中成药茵陈四苓颗粒源于茵陈蒿汤，具有疏肝补脾、清热解毒和利湿的功效，但其具体的治疗机制尚不明确。本研究采用α-异硫氰酸萘酯(alpha-naphthylisothiocyanate，ANIT)灌胃法制备CH动物模型，观察了茵陈四苓对CH大鼠肝功能的改善作用及血清白介素-17(IL-17)和干扰素-γ(IFN-γ)等细胞因子的变化，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立 30只雌性SD大鼠，体质量为(200±20)g，购于昆明医科大学实验动物中心(合格证号为16054411)。随机将动物分为对照组、模型组和茵陈四苓颗粒处理组，每组10只。适应性饲养1 w，自由饮用纯净水，饲养环境相对湿度为60%，环境温度为22～25℃，进食高压消毒灭菌不含致敏原的饲料，每周更换垫料2～3次，每12 h交替光照。对照组不予任何特殊处理；模型组以100 mg.kg-1ANIT经口灌胃，制备CH大鼠模型，灌胃前后12 h自由饮水，禁食，12 h后恢复正常饮食。每周灌胃1次，连续3 w。在第3次灌胃后48 h，予以20%乌拉坦(0.5 ml/100 g)腹腔注射麻醉，无菌条件下留取腹主动脉血和肝组织标本；在药物处理组，以模型组相同方法制备CH大鼠模型，并于造模结束后给予茵陈四苓颗粒2.0 g.kg-1溶解于饮用水后经口灌胃，3次/d，持续3 w。标本留取方法同模型组。实验过程符合《中华人民共和国实验动物管理条例》的有关规定。

1.2 主要仪器、试剂和药物 全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)；低温高速离心机(美国Sigma公司)；实时荧光定量PCR仪(美国赛默飞公司)；蛋白质核酸电泳分析仪(美国Bio-Rad公司)；酶标仪(美国Thermo公司)；显微镜、显微摄像及图像分析系统(日本Olympus公司)；ANIT(美国Sigma公司)；兔抗鼠IL-17、抗IFN-γ、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒(武汉明浩生物科技股份有限公司)；反转录试剂盒(美国Fermentas公司)；引物由上海信裕生物科技有限公司设计；茵陈四苓颗粒(西南医科大学附属中医医院，川药制字Z20070525)。

1.3 实验室检测 经腹主动脉抽血6 ml，置于真空干燥管，室温静置0.5 h，离心(3000 r/m，10 min)，将上清液分装后，保存于-20℃待测。采用ELISA法检测血清IL-17、IL-4、IFN-γ水平；采用比色法检测血清SOD和MDA水平。取肝组织，以10%中性福尔马林溶液固定，脱水、石蜡包埋，采用HE染色，观察肝组织病理学变化。另取肝组织，置于液氮中迅速冷冻，保存于-80℃,使用试剂盒提取总RNA，逆转录合成cDNA，设计合成引物，IL-17上下游引物分别为：5′-GGGAAGTTGGACCACCACA-3′、5′-CCCACCAGCATCTTCTCCA-3′；IFN-γ上下游引物分别为：5′-CATCAGCAACAACATAAGTGTCATC-3′、5′-CATTGACAGCTTTGTGCTGGA-3′；SOD上下游引物分别为：5′-GGGGTACCCTTATGGCGACGAAGGCCGTG-3′、5′-GCTCTAGATTATTGGGCGATCCCAATTACA-3′； 法尼酯X受体(FXR)上下游引物分别为：5′- GCAACTGCGTGATGGATATG-3′、5′- TTCTCCCTCGCATAGCTTGGT -3′；建立PCR反应体系，采用PCR法检测IL-17、IFN-γ、SOD和FXR mRNA水平。

2 结果

2.1 三组大鼠血清肝功能指标比较 药物干预组动物血清ALT、AST、ALP、TBIL和GGT水平显著低于模型组(P<0.05，表1)。

2.2 三组大鼠血清炎症因子水平比较 药物干预组动物血清IL-17、IFN-γ和MDA水平显著低于模型组，而血清SOD水平显著高于模型组(P<0.05，表2)。

2.3 三组大鼠肝组织病理学变化 见图1。

表1 三组血生化指标比较

与模型组比，①P<0.05；与对照组比，②P<0.05

表2 三组血清炎症因子水平比较

与模型组比，①P<0.05；与对照组比，②P<0.05

图1 三组大鼠肝组织病理学变化(HE，100×)A：对照组大鼠肝组织结构正常；B：模型组大鼠肝小叶结构破坏，肝细胞肿胀，呈水样变性和羽毛样变性，胆管上皮细胞肿胀、空泡化和坏死，腔内可见脱落的胆管上皮细胞碎屑，部分肝细胞和胆小管腔内可见微胆栓形成，汇管区胆管扩张，纤维组织增生，中性粒细胞浸润，肝窦明显扩张；C：药物干预组大鼠肝组织小叶结构基本完整，少量炎性细胞浸润，肝细胞形态基本正常，汇管区无纤维组织增生

2.4 三组大鼠肝组织IL-17、IFN-γ、SOD、FXR mRNA水平比较 药物干预动物肝组织IL-17和IFN-γ mRNA水平显著低于，而SOD和FXR mRNA水平显著高于模型组(P<0.05，表3)。

表3 三组肝组织炎症因子mRNA水平比较

与模型组比，①P<0.05；与对照组比，②P<0.05

3 讨论

长期的胆汁淤积可因淤积的胆汁酸破坏生物膜的脂质成分导致肝细胞发生变性、坏死，引起肝组织汇管区和小叶炎性细胞浸润，进而诱发肝脏的持续慢性炎症及纤维化，最终导致肝硬化的发生。此外，反复出现的高胆红素血症也容易诱发急慢性肝功能衰竭等不良临床结局。ANIT是一种间接性的肝脏毒性物质，其作用机制为增强肝脏的过氧化过程，从而增加氧自由基的生成，导致肝细胞膜发生脂质过氧化反应，引起肝细胞变性、坏死。此外，它还可以直接导致肝内胆管上皮细生及小叶间胆管周围炎症，引起肝内胆管阻塞，最终导致广泛性的胆汁淤积[4]。采用该方法制备CH动物模型，动物生化指标改变较为准确，可以较好地模拟临床肝内胆汁淤积患者的病理生理变化，我们的研究结果也提示采用ANIT造模后大鼠肝脏生化及病理学变化与CH患者临床病变特点具有较好的吻合，为后续应用茵陈四苓颗粒进行药效学研究提供了良好的动物模型。

CH主要的发病机制为肝细胞损害导致坏死后胆红素和胆汁酸等物质排泌障碍；毛细胆管上皮肿胀、受压，小胆管内胆栓形成；肝细胞坏死、毛细胆管破裂，血胆屏障受损，胆红素等进入血液等引起肝内胆汁淤积[5-7]。本研究结果显示，茵陈四苓颗粒干预组大鼠肝损害减轻。经茵陈四苓颗粒处理后动物肝脏病理学损害明显改善，提示茵陈四苓能够有效抑制肝细胞炎症反应，减少胆管上皮细胞肿胀、变性和坏死，促进肝细胞再生，保持胆管通畅。

多项研究[8-12]已证实，过氧化和炎症因子失衡等共同参与了CH的发病过程。IL-17是来源于T细胞的细胞因子，可促进T细胞激活，刺激内皮细胞、上皮细胞等分泌巨噬细胞刺激因子、IL-6、IL-8等多种细胞因子，介导炎症的产生。有研究结果显示其是T细胞诱导炎症反应早期启动因子，Th17细胞能通过分泌IL-17，参与急性肝损伤和肝内炎症过程。有学者报道肝炎患者肝细胞IL-17表达量明显高于健康人群。IFN-γ可由T细胞、Th1细胞等产生，结合受体后可激活中性粒细胞、自然杀伤细胞等，促进炎症发生。有研究[13]结果显示IFN-γ可导致肝实质细胞坏死，诱发肝脏炎症反应。MDA来源于脂质过氧化过程，是氧自由基攻击生物膜中的多价双键不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用而形成的产物，可反映细胞受活性氧、自由基攻击程度。SOD与MDA具有相反生理功能，具有较强抗氧化作用，间接反映机体清除氧自由基的能力[14]。研究[15]证实慢性肝损伤大鼠肝细胞MDA表达量较高，SOD呈低表达状态。本研究结果显示，茵陈四苓颗粒干预组血清及肝组织IL-17、IFN-γ、MDA水平低于模型组，SOD水平高于模型组(P<0.05)，说明茵陈四苓颗粒可改善炎症反应，提高抗氧化能力，这可能是其改善CH肝功能损害的作用机制之一。

FXR系核受体超级家族孤核受体，在肝脏胆汁酸、脂质代谢、肝脏炎症和肿瘤的发展过程中起着重要的调控作用，是近年来胆汁淤积的研究热点之一[16]。FXR能通过作用于替代途径限速酶CYP27A及胆汁酸合成经典途径限速酶CYP7A1，抑制胆汁酸合成[17]。FXR对胆汁酸的合成、解毒和转运以及肝纤维化形成等方面均有作用[18]，其作用机制考虑为FXR能够通过其下游分子小异源二聚体伴侣受体(small heterodimer partner，SHP)抑制胆汁酸的合成，诱导肝内胆汁酸的排泄，增加胆汁的流动，增加胆汁中磷脂的含量。目前，FXR被认为是治疗胆汁淤积类疾病最有前景的靶点[19，20]，但相关药物仍处于研发阶段，需大量可靠基础实验和临床试验进行验证。本研究结果显示，茵陈四苓颗粒干预组动物血清指标和肝组织损伤程度均得以减轻，是否具有药用价值，值得进一步研究。