一株反硝化聚磷菌的筛选与特性研究*

李 澳，胡 月，孙 玲，孟 娜，于楠楠

(徐州工程学院，江苏 徐州 221008)

氮、磷污染物是导致众多内陆湖泊、水库甚至河流水体富营养化的主要因素，它们的协同去除是污水生物处理的主要目标。常规的生化处理工艺可以有效地降低污水的BOD5和SS，但对污水中同时存在的N、P等营养物只能去除10%～20%，大量含磷污水直接排入水体。在近30多年里，许多污水厂在设计上都考虑到了利用微生物对N、P的同步去除。然而，由于硝化菌与传统聚磷菌(PAOs)的菌龄不同及反硝化菌与PAOs在碳源需求上的竞争，使得它们在脱氮除磷过程中存在着较大矛盾，系统难以达到最优运行条件。20世纪末，人们发现在厌氧/缺氧交替运行的环境中能够富集到一类兼有脱氮和除磷特性的PAOs，并把它们单独列出，称为反硝化聚磷菌(Denitrifying phosphorus accumulating organisms，DNPAOs)，它们的发现为解决碳源利用和泥龄差异的矛盾提供了可能，使得脱氮除磷得以同步进行。目前，国内外在反硝化聚磷菌的分离筛选方面的研究已有一定的进展：2003年Wauters G等[1]分离到1株丛毛单胞菌属的DNPAOs；2004年Suguru O等[2]分离到1株红环菌属的DNPAOs；2008年许彦娟[3]分离到1株微小杆菌属和3株芽孢杆菌属的DNPAOs；2009年Cao Ngoc Diep等[4]分离到1株假单胞菌属的DNPAOs；2011年Hui LIU等[5]分离到1株副球菌属的DNPAOs；2018年谢蔚鹏等[6]分离到24株反硝化聚磷菌，可归于5个不同的属，分别是芽孢杆菌属、丛毛单胞菌属、普罗维登斯菌属、假单胞菌属和假苍白杆菌属。本研究依据除磷能力、硝酸盐还原产气及异染颗粒染色等实验，对DNPAOs进行分离筛选，得到1株高效同步脱氮除磷的DNPAOs，丰富和补充了生物反硝化除磷理论。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

723C可见分光光度计；SW-CJ-1F洁净工作台；HZ150L恒温培养摇床；IXQ-SG46-280A手提式压力蒸汽灭菌锅；BCD-212KA海尔冰箱；HH.B11.600-S-II电热恒温培养箱；XMTD-204数显恒温水浴锅；150B生化培养箱等。

试剂除LB为生化试剂外，其余均为分析纯，pH的调节采用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH。

1.2 培养基

(1)LB培养基：酵母浸膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，双蒸水1000 mL，pH 7.0～7.2(若为固体则加入琼脂25 g)。

(2)LB-P培养基：LB培养基添加2.5 g K2HPO4和0.25 g KH2PO4，pH 7.0～7.2。

(3)富集培养基：CH3COONa·3H2O 5 g、丙酸5 mL、KNO32.0 g、MgSO4·7 H2O 0.2 g、K2HPO42.0 g、微量元素2 mL、双蒸水1000 mL；pH 7.2。

(4)1% BTB-反硝化培养基：CH3COONa·3H2O 5.0 g、KNO32.0 g、MgSO4·7 H2O 0.2 g、琼脂20 g、1%-BTB 4 mL、H2O 1000 mL；pH 7.6。

(5)反硝化缺磷培养基：KNO32 g/L、CH3COONa·3H2O 5 g/L、K2HPO40.05 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl20.5 g/L、微量元素2 mL/L。

(6)反硝化富磷培养基：KNO32 g/L、CH3COONa·3H2O 5 g/L、K2HPO40.05 g/L、KH2PO40.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl20.5 g/L、微量元素2 mL/L。

(7)微量元素溶液：FeCl3·6H2O 1.5 g/L、H3BO30.15 g/L、CuSO4·5H2O 0.03 g/L、KI 0.03 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.06 g/L、MnCl2·4H2O 0.12 g/L、ZnSO4·7H2O 0.12 g/L、CoCl2·2H2O 0.12 g/L。

1.3 反硝化聚磷菌的富集培养与筛选

1.3.1 菌株富集培养

从徐州市的几个污水处理厂采集活性污泥，混合后称取10 g，加入200 mL富集培养基中，26 ℃、140 r/min摇床厌氧/缺氧间歇培养，每4 d为一周期(每一周期前2 d以乙酸钠提供碳源，后2 d以丙酸提供碳源，每次置换培养液的50%)，共培养10个周期。培养结束后吸取0.5 mL富集液，进行10-1～10-9浓度梯度稀释，从各梯度的稀释液取0.1 mL分别涂布LB固体培养基，每个稀释度2个重复，于生化培养箱26 ℃下培养2～3 d。选取形态清晰的单菌落划线分离培养，长成的单菌落再转接，重复划线培养6次，即得纯菌落。

1.3.2 菌株筛选

①蓝白斑初筛：对已分离纯化的菌株取单菌落，分别点接于1% BTB-反硝化培养基上，于26 ℃培养2 d，选择显蓝色的菌株作为初筛菌株。

②Albert颗粒染色复筛：将上述筛选出的菌株缺氧培养12 h后，进行Albert异染颗粒染色，选择具有异染粒染色的菌株为反硝化聚磷菌。LB培养基斜面接种，4 ℃保存备用。

③将上述筛选出的反硝化聚磷菌分别接入100 mL LB液体培养基中，26 ℃，140 r/min摇床培养24 h，4000 r/min离心20 min收集菌体，调整OD600=1.0，无菌生理盐水保存，即为种子液。

除磷率：η1=(C-Ct)/C×100%

(1)

反硝化率：η2=(A-At-Bt)/A×100%

(2)

式中：η1——除磷率，%

η2——反消化率，%

选取1株反硝化率和除磷率分别大于70%和50%的菌株为实验菌株。

1.4 分析方法

1.5 菌株特征及生理生化鉴定

参照文献[7-8]方法进行。

1.6 菌株16SrDNA基因片段PCR扩增

以细菌基因组DNA为模板扩增16SrDNA，采用一对通用引物，上游引物(7F)：5-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’；下游引物(1540R)：5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’；PCR反应体系：Template 0.5 μL，5×Buffer(with Mg2+)2.5 μL，dNTPs 1 μL，上游和下游引物各0.5 μL，加双蒸H2O2至25 μL。PCR程序如下：① 98 ℃，预变性，3 min；② 98 ℃变性25 s；③ 55 ℃复性25 s；④ 72 ℃延伸1 min；⑤ 72 ℃延伸10 min；⑥ 4 ℃终止反应，其中步骤②至④循环30次。琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并送中国上海生工生物技术有限公司测序。

1.7 菌株生长影响因素(不同因素对菌株生长及反硝化除磷性能的影响)

1.7.1 不同 pH 值

1.7.2 不同温度

1.7.3 不同碳源

1.8 菌株脱氮除磷性能

2 结果与讨论

2.1 菌株的富集与筛选

取混合物样品10 g置于200 mL乙酸钠/丙酸为交替碳源的富集培养基中，26 ℃下，140 r/min摇床培养40 d后，涂布LB固体培养基，共挑出形态、大小、颜色不同的菌落48株。分别挑单菌落接种于1%BTB-反硝化培养基进行蓝白斑筛选，显蓝斑的共有23个菌落，为反硝化菌，命名为N1-N23。对N1-N23厌氧吸磷培养后进行Albert异染粒染色，染色结果表明有8株菌体(N2、N3、N6、N9、N11、N13、N14、N23)含有poly-P颗粒，结合蓝白斑筛选与异染粒染色结果确定这8株菌为反硝化聚磷菌。

表1 好氧培养24 h菌株反硝化除磷结果

由表1可知，菌株N6、N11、N13、N14、N23的反硝化率均大于70%，除磷率均大于50%，对这5株菌株进行硝酸盐还原产气实验，结果N6、N13为阴性，N11、N14、N23为阳性，选取反硝化率和除磷率均较高的N14为进一步研究的高效反硝化聚磷菌。

2.2 N14特征

N14菌落奶白色，大小为0.5 μm×1.0 μm，边缘整齐、光滑，表面湿润，中间凸起，半透明，易挑起。显微镜下可见菌株粗短杆状，多数单个，极少数呈短链状。菌体Albert 异染粒染色结果见图1，从图1可知，菌体内含有poly-P颗粒。

图1 菌株N14的poly-P染色

2.3 N14鉴定

N14为革兰氏阴性菌，无芽孢，有厚荚膜，有运动性；硝酸盐还原、硝酸盐还原产气、淀粉水解、柠檬酸盐利用、过氧化氢酶实验阳性；产氨、产H2S、V-P、甲基红、产吲哚阴性，初步鉴定菌株为克雷伯氏菌。以菌株总DNA为模版，经PCR扩增及16SrDNA测序，结果发现其于已知的克雷伯氏属Klebsiellasp. DAP24(登录号：EU302849)的相似性达98%。因此经鉴定菌株N14为克雷伯氏菌Klebsiellasp.，命名为Klebsiellasp. N14。

2.4 不同因素对N14脱氮除磷性能的影响

2.4.1 pH值

pH值影响细胞在培养基中的带电状态和氧化还原电位，从而影响微生物对营养物质的吸收和酶促反应的进行，因此pH变化对菌株脱氮除磷产生较大影响。由图2可知，菌株在pH为5～8范围内OD600、脱氮率、除磷率逐步上升，在pH为8时生长最好，此时OD600为1.26，脱氮除磷效能最佳，除磷率为81.6%，脱氮率为87.9%；但pH为5时OD600仅为0.28，脱氮除磷率最低，脱氮率为20.5%，除磷率为32.8%，显示此条件下菌株生长缓慢，脱氮除磷效果不理想；菌株在pH为9的条件下也能较好的生长，此时OD600为0.95，脱氮率除磷率依然保持在71%、65%左右。可见反硝化聚磷菌N14脱氮除磷最适宜的pH为中性及弱碱性，这与胡筱敏等[9]研究结果相一致。菌株在pH为5～9范围内生长吸光度与脱氮除磷率呈简单的正态分布，表明菌株脱氮除磷效能与生长代谢呈正相关。全程没有检测到氨氮浓度，这与生理生化鉴定时产氨反应阴性相一致，也进一步验证了硝酸盐还原产气生成的气体为N2。

图2 pH对菌株N14生长及脱氮除磷性能的影响

2.4.2 温 度

通常情况下，温度对细菌生长和代谢有如下影响：在温度低至一定值时，细菌细胞膜呈凝胶状，营养物质的跨膜运输受阻，细胞停止生长；随着温度的升高，细菌细胞内的生化反应加快，生长加速；当温度升高超过上限温度后，对温度敏感的蛋白质和核酸变性加剧，细菌生长停止，甚至死亡。因此，在其它条件不变情况下，细菌生长有最适生长温度区间。由图3可知，菌株在好氧培养24 h后，在20～30 ℃范围内OD600、脱氮率、除磷率逐步上升，20 ℃时OD600为0.89，脱氮率、除磷率分别为70.5%、50.2%，可见此温度下菌株能较好的生长，且维持较高的脱氮除磷率，暗示N14可能耐受低温生长，可作为耐冷反硝化聚磷菌备选菌种；25 ℃时除磷率最高，为86.2%；30 ℃时OD600、脱氮率达最高值，OD600为1.28，脱氮率为88.2%，除磷率为82.7%；35 ℃时OD600、脱氮除磷率略有下降，40℃时明显降低，OD600为0.47，脱氮除磷率分别为40.8%、37.6%。菌株适宜生长的温度范围是20～30 ℃。

图3 温度对菌株N14生长及脱氮除磷性能的影响

2.4.3 碳 源

图4 碳源对菌株N14生长及脱氮除磷性能的影响

2.5 N14脱氮除磷效果

图5 N14脱氮除磷性能

3 结 论

(1)以乙酸钠/丙酸为交替碳源，对活性污泥进行为期40 d厌氧/缺氧培养，通过蓝白斑筛选、poly-P染色、硝酸盐还原产气及脱氮吸磷效能实验相结合的方法，筛选到1株高效反硝化聚磷菌N14，经16SrDNA基因序列分析及生理生化实验，初步鉴定菌株N14为Klebsiellasp.，命名为Klebsiellasp.N14。

(2)菌株N14对pH的耐受范围较广，其脱氮除磷的适宜pH是中性偏碱，最适pH是8；适宜生长的温度范围在20～35 ℃之间，脱氮除磷的最适温度是30 ℃；当碳源为乙酸钠时，菌株生长及脱氮除磷效能最佳，碳源为柠檬酸钠时，菌株脱氮除磷效果最差。

(3)菌株在pH为8，温度为30 ℃条件下好氧培养24 h后，培养液上清液中磷浓度从81 mg/L降到12.4 mg/L，除磷率为88.5%，硝酸盐氮浓度从180 mg/L降到15 mg/L，亚硝酸盐氮浓度从94 mg/L降到6.7 mg/L，脱氮率为84.7%。