近红外光谱分析在玉米单籽粒品种真实性鉴定中的影响因素

赵怡锟， 于燕波， 申兵辉， 杨勇琴， 艾俊民， 严衍禄， 康定明*

1. 中国农业大学农学院， 北京 100094 2. 中国农业大学理学院， 北京 100094 3. 中国农业大学信息与电气工程学院， 北京 100094

引 言

作物品种真实性的鉴定， 传统上多用表型鉴定和当下广为应用的DNA或蛋白质分子鉴定。 然而， 这两种方法不仅耗时费力， 对环境也有污染[1-3]。 而近红外光谱检测具有快速、 无损样品、 环境友好的特点， 已应用于多种作物种子的品种真实性鉴定， 以及种子营养成分含量的检测[4-6]。 杨传得等利用近红外反射光谱检测花生种子含水量， 模型决定系数(R2)为0.936 2[7]。 王传梁等用近红外漫反射光谱分析大米籽粒的脂肪含量， 决定系数为0.988 9[8]。 张初等基于反向传播神经网络进行了近红外光谱对于西瓜种子品种真实性的鉴定[9]。 但近红外光谱检测因易受过程处理和环境的影响， 光谱信号波动大， 检测结果的可重复性和稳定性较差， 在归类判别类型的定性检测中应用受到极大限制。 同一种子批随着时间的推移， 其光谱会产生变化， 因此某一时间建立的模型对其他时间所采集的光谱的鉴别率会下降， 最终导致模型的稳定性下降； 但目前我国对近红外光谱分析模型稳定性的研究不多， 影响该项技术的实际应用。

玉米是主要粮食作物之一， 玉米种子真实性的检测鉴定， 在良种培育、 种子生产和经营中需要频繁进行。 目前玉米自交系和杂交种子的真实性鉴定， 种子生产和经营中常采用特征同工酶聚丙烯酰胺蛋白电泳凝胶谱带技术[10]， 以及通过DNA特征位点的PCR扩增来鉴定识别品种真实性[11-12]， 但上述方法技术复杂， 成本较高， 耗时长， 不能进行实时在线分析。 近红外光谱技术可以用于玉米真实性鉴定。 唐兴田等利用仿生模式识别建模， 进行了玉米品种真实性鉴定， 平均正确识别率和平均正确拒识率达到94.5%和96.71%。 但还不能对非建模时间段采集的样品进行预测， 对不同存储时间下玉米种子的预测也没有研究， 不同种子存储时间带来的模型不稳定性问题没有解决。

为此， 我们将近红外光谱检测技术用于玉米品种真实性鉴定， 选用10个相同地点和相同时间生产的玉米杂交种及自交系的种子， 研究玉米种子存储时间的长短对近红外光谱检测结果可重复性和稳定性的影响， 进而通过一年间不同时段的对相同种子批样品的持续光谱采集， 最后针对采集到的所有近红外光谱数据， 进行联合建模， 由此来判别分析下一年度采集相同样品的光谱检测结果， 用模型对检测样品的正确鉴别率来分析玉米种子存储时间对模型预测结果的稳定性和可重复性的影响。

1 实验部分

1.1 材料与光谱采集

玉米种子为收获于2015年产自甘肃张掖的玉米杂交种和自交系种子， 共12个品种， 1440份样品。 10个品种作为实验组， 2个作为对照组， 对照组将作为非标准样品掺入建模集， 参与真实性建模， 其中4CV-C72作为杂交品种非标样， 郑58作为自交系非标样， 详细信息见表1。

表1 12个品种详细信息

近红外光谱数据采集采用MicroNIR 1700近红外微型光谱仪， 数据分析软件为Matlab®(Mathworks, Inc, U.S.)。

所有收获的样品在室内通过均匀干燥， 再加湿的方法， 使样品水分处于10%～11%， 密封后， 平衡水分1周。 样品筛选， 每个品种挑选籽粒完整， 颜色一致的种子120粒。 光谱采集前， 光谱仪需预热45 min， 之后进行单籽粒光谱数据采集。 采集方式为漫反射， 积分时间为10 000 μs， 积分次数为400次， 采集时间4秒， 在每粒种子胚面位置采集光谱3次， 取平均值， 每组种子采集完光谱， 单粒种子逐一做标记， 室温通风处存放。

为使1年中采集的光谱数据时间相隔均匀， 以月为单位， 1年分为12个采集光谱时间段， 每月采集4次， 分别在每月4， 11， 18和25日上午(9点—11点)， 下午(14点—16点),晚上(19点—21点)3个时间点进行， 以此作为每月的光谱数据。 每天的单个时间点每个品种采集10条光谱， 1天3个时间点， 每天合计30条光谱， 每月120条光谱。

1.2 方法

对原始光谱进行平滑预处理(平滑窗口长度为9)， 消除噪声干扰， 然后使用一阶差分导数(差分宽度为9)放大差别， 消除基线和其他背景干扰， 分辨重叠峰， 提高分辨率和灵敏度， 最后用矢量归一化降低同一品种玉米籽粒光谱若干次采集间的差别。

在上述预处理的基础上， 采用PLS-DA建立品种真实性鉴别模型， 以月为单位， 从每品种单月采集的120条光谱中选取前90条作为建模集， 用于建立预测模型， 后30条作为测试集。 即JK968的建模集由2016年1月采集的90条JK968与90条4CV-C72光谱组成， 测试集由2月采集的30条JK968与30条4CV-C72光谱组成， 以此类推， 其他各品种建模集和预测集相同方法建立。

本研究用正确鉴别率(correct identification rate， CIR)来评价模型性能， 其计算方式为： (模型正确鉴别样品个数+模型正确拒识样品个数)/参与测试样品总数。 最终通过主成分分析以及模型正确鉴别率来综合分析玉米种子存储时间对近红外光谱分析结果的影响程度。

2 结果与讨论

2.1 不同玉米种子存储时间的种子真实性鉴定结果

为了探究玉米籽粒存储时间对玉米品种真实性的近红外光谱单籽粒预测模型稳定性的影响， 利用1月份光谱数据建立品种真实性鉴定模型(单月建模)， 分别鉴定2到12月的相同品种， 结果如图1所示， 纵坐标表示1月份建立的单月模型对2到12月每月测试集鉴定的正确鉴别率， 结果显示， 正确鉴定率均呈逐月下降的趋势， 其中， J724的正确鉴别率由98.33%下降至63.33%， 下降较明显。 同时， 同一品种的同一种子批， 由储藏开始建立的品种真实性鉴定模型已无法对储藏11个月后的该种子批进行高准确度的鉴定(所有样品1月份单月模型对12月测试集鉴定的正确鉴别率均在83.33%以下)。 这说明玉米种子的存储时间越长将降低应用近红外光谱鉴定品种真实性的鉴定准确度。

图1 基于1月份单月所建模型对2月至12月测试集的鉴别结果

2.2 玉米种子存储时间变化导致光谱数据离散

为研究模型随玉米种子样品存储时间的变长， 鉴定结果不稳定的原因， 用10个品种的2016年1月到12月的光谱数据来剖析， 随着玉米种子储存时间的推移， 样品光谱数据的变化。

以杂交种JK968， 自交系6WC为例， 图2为JK968与6WC的原始光谱经过预处理后， 通过主成分分析将光谱数据降维后得到的2维图( 图中“□”表示1月份光谱数据， “○”表示6月份光谱数据， “△”表示12月份光谱数据)， 由图可见， 不管是JK968或是6WC， 玉米种子不同存储时间样品的光谱呈现不同程度的离散， 1月份和6月份JK968的光谱数据在特征空间中有部分重叠， 而12月份的光谱数据与1月份的相对距离较远， 几乎在空间内分开， 说明无论是杂交种还是自交系， 应用近红外光谱进行玉米种子真实性单籽粒鉴定时， 同一品种样品的光谱数据会随着玉米种子样品的存储时间推移产生离散变化， 在玉米种子样品存储11个月后， 这种离散变化更加显著， 重复性一致性越低， 使得玉米种子的真实性鉴定结果的准确性越低。

2.3 扩充模型包容性， 增加鉴定结果稳定性

同一种子批在1年的不同时段月份采集的光谱数据产生变化， 即延长玉米种子的储存时间会导致模型的正确鉴别率下降。 针对上述问题， 用扩充模型的包容性来消除因建模数据与检测样品数据时间跨度较大对近红外光谱检测玉米种子品种真实性鉴定的影响。 用稳定性(也称容变性)来评价玉米种子品种真实性鉴定的近红外光谱模型， 模型的稳定性指模型适配范围的大小， 主要决定于建模光谱集中不确定信息(背景信息)变动的范围。

图2 1月， 6月， 12月预处理后光谱数据PCA分析结果

背景信息是检测样品存储时间变量所带来的， 随着玉米种子存储时间的延长， 存储环境变化的温度、 湿度， 空气中水分等外界因素都可能会引发玉米种子内部有机物含量的变化， 而由此干扰不同时间段采集到的近红外光谱的一致性， 从而使得在这些光谱数据基础上建立的模型的稳定性。 我们通过扩充建模集中受干扰的信息的范围， 即将1年内在不同时间段里， 也即在不同环境因素、 仪器因素及种子样品等变化因素下采集到的光谱数据， 均扩充到建模光谱数据中， 以增加根据扩充数据建立的近红外光谱预测模型的包容性。

包容性模型的具体建立方法， 以JK968为例， 如表2所示， 模型编号1-2表示1月与2月建模集联合后建立的包容性模型(联合建模)， 之后分别对2016年3月—12月测试集的样品进行鉴定， 之后逐月增加建模集光谱数据， 并对非建模集所在月份进行逐月鉴定， 例如， 1—11表示将1月至11月的建模集进行联合建模， 对12月测试集进行鉴定。 可以看出， 模型1-2至1-5整体呈现出图4相同的趋势， 即模型对建模集相邻月份的测试准确度较高， 之后逐月降低。 当建模集内加入1月—6月份建模集内的特征光谱后， 包容性模型的平均正确鉴别率可稳定在92%以上。

通过以上方式， 对10个玉米品种进行了测试， 结果见表3， ACIR(单月建模)表示1月单独建模分别鉴定2月—12月测试集的正确鉴别率平均值， ACIR(联合建模)表示所有包容性模型对其非建模所在月份测试集鉴定后正确鉴别率的平均值， 可以看出， 包容性模型的平均正确鉴别率相较于单月模型均有明显提高， 其中J92与XY211的平均正确鉴别率分别提高11.58%与7.71%。

表3 联合建模的平均正确鉴别率

表4 基于2016整年联合建模的模型对于2017年测试集鉴别结果

Table 4 Identification results of cross-modeling by dataset of 2016 whole year， data collected in 2017 for test(Unit： %)

样品名称平均正确鉴别率样品名称平均正确鉴别率FH1096.994CV90.50JK96892.866WC93.02LD1689.54C7297.17XY21196.30J9297.63YY597.72J72496.82平均值94.68平均值95.03

总的看来， 为使近红外光谱的玉米种子真实性单粒鉴定的正确鉴别率进一步提高， 将2016年整年采集的光谱数据均加入到包容性模型的建模集中， 并对模型进行为期一整年的测试， 测试集为2017年1月—12月采集的光谱， 测试结果见表4， 表中所示平均正确鉴别率为2016年包容性模型对样品2017年每个月测试集鉴定后的正确鉴别率平均值。 可以看出， 除了LD16的平均正确鉴别率为89.54%， 其他样品均在90%以上， 另外， 玉米杂交种全年的平均正确鉴别率为94.68%， 自交系为95.03%， 10个玉米品种的平均正确鉴别率为94.86%。

3 结 论

以同一产地， 同一收获时间的10个玉米品种为对象， 研究玉米种子的存储时间对近红外光谱玉米种子品种真实性单籽粒鉴定的影响程度。 结果表明: 种子存储时间的延长会直接降低近红外光谱对玉米种子品种真实性单籽粒鉴定的正确鉴别率。 故此， 提出了扩充模型的包容性， 来解决玉米种子存储时间变量对模型稳定性的影响。 通过联合建模， 包容性模型较于单月模型的正确鉴别率明显提高。 同时， 为进一步提高模型的正确鉴别率， 将2016年整年的光谱数据均加入包容性模型的建模集中， 提高模型应对光谱采集时间、 环境等可能不一致条件的应变能力， 增强模型的稳定性， 使测试集玉米杂交种2017年的平均正确鉴别率达到94.68%， 自交系达到95.03%， 为进一步研发专用模型和实用设备提供基础。

对于玉米种子存储时间的延长所导致的光谱变化的具体原因， 将在后续研究结果中报道， 以期对进一步提高近红外光谱玉米种子单籽粒品种真实性鉴定模型的正确鉴别率有指导意义。