茅苍术麸炒品对人肝癌SMMC-7721细胞的体内外抑制作用▲

罗吉辉 杨熙华 肖方涛 周美华

(湖南省郴州市第一人民医院南院肿瘤外科二区，郴州市 423000，电子邮箱:Luojihui123@163.com)

在全球范围内每年有超过50万的新诊断肝癌患者[1-2]，而我国的肝癌发病率居高不下[3]，该病具有生长非常迅速、侵袭转移能力强、恶性度高和治疗效果差及预后不佳等特点[4]。患者早期无任何症状和体征，一旦身体出现不适症状，有可能已经失去了最佳手术机会[5]。鉴于以上原因，寻找治疗肝癌的有效药物迫在眉睫。茅苍术也被称为南苍术，主要分布于江苏茅山等地区[6-7]。现代药理学研究发现，茅苍术具有抗痛风，治疗夜盲症、原发性高脂血、膝关节骨关节病和外阴瘙痒等作用[8-9]。近年来，多项研究显示茅苍术对动物移植性肿瘤S180、小鼠淋巴肉瘤细胞、Lewis肺癌细胞、食管癌和胃癌细胞等的生长都有抑制作用，其作用机制可能与其促进细胞凋亡等有关[10-11]。中药炮制是中医药应用的关键，茅苍术为常见的临床中药，其生品燥性较强，多经过炮制后应用，而目前应用最为广泛的炮制品种是麸炒茅苍术[12]。因此，本研究探讨茅苍术麸炒品在体外对肝癌SMMC-7721细胞活性和凋亡的影响；并建立肝癌SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤模型，观察茅苍术麸炒品在体内对肝癌的抑制作用，以及对肿瘤组织中B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相关性X蛋白(Bcl-2 associated protein,Bax)和Survivin蛋白表达水平的影响，从而为研究茅苍术麸炒品治疗肝癌提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株和实验动物 SMMC-7721人肝癌细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司(编号ZQ0029)。 无特定病原体级BALB/c裸鼠24只，雌雄各半，4～6周龄，体质量约16 g，由广西医科大学动物实验中心提供[合格证号:SCXK(桂)2014-0002]。裸鼠放置在无特定病原体的隔离器中繁殖，饮用经过0.2 μm过滤器除菌的超纯水。本研究所有动物实验均符合中国伦理委员会的相关要求。

1.2 药品及试剂 茅苍术购于三原天域生物制品有限公司；杜氏改良伊戈尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM) 和胎牛血清购于美国Gibco公司(批号：C11995500BT、10099-141)；细胞计数法(cell count kit-8,CCK-8)试剂盒、结晶紫染色液、普通RIPA裂解液、二喹啉甲酸蛋白浓度测定试剂盒和双抗(青链霉素1 ∶100 溶液)购于北京索莱宝科技有限公司(批号：CA1210、 P1400、R0020、PC0020和P1400-100)；细胞凋亡Hoechst染色试剂盒购于碧云天生物技术有限公司(批号：C0003)；Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒购于美国BD公司(批号：550474/559925)；Bcl-2、Bax、Survivin、内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗抗体和二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)购于沈阳万类生物科技有限公司(批号： WLO1556、WLO1637、WLO3492、WLO1114和WLA023)。

1.3 仪器 Olympus倒置显微镜(上海普赫光电公司，型号：IX53)；倒置荧光显微镜(广州市明慧科技有限公司，型号：MHFL-2000)；Varioskan LUX 多功能酶标仪；2000超微量紫外/可见分光光度计(美国Thermo公司)；快速转膜仪和电泳仪(美国Bio-Rad公司，型号：170-4155)；流式细胞仪(贝克曼库尔特公司，型号：CytoFLEX)；超纯水机(力康生物医疗科技控股有限公司，型号：SmartPlus-E)。

1.4 茅苍术工作液的配制 麸炒茅苍术为郴州市第一人民医院中医科实验研究中心按照《中国药典》2010年版[13]中有关苍术的“麸炒法”进行炮制。然后将茅苍术麸炒品粉碎，用双蒸水混悬均匀，置震荡仪震药24 h后用一次性的0.45 μm针式过滤器进行过滤，临用前用超纯水稀释成相应的浓度待用。

1.5 细胞实验

1.5.1 细胞培养：将SMMC-7721细胞置于含10%胎牛血清和双抗的DMEM培养基中，在5% CO2、37℃的细胞培养箱进行培养。

1.5.2 CCK-8法检测细胞活性：取对数生长期的SMMC-7721细胞，接种于96孔板中，每孔体积100 μL，密度为2×103个细胞/孔，将孔板置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。待细胞完全贴壁后，每孔加入100 μL含有0 μg/mL(对照组)、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL和600 μg/mL茅苍术麸炒品的完全培养液。在37℃，5% CO2细胞培养箱中培养24 h后，每孔加入CCK-8试剂(10 μL)；继续在细胞培养箱内孵育2 h后，用酶标仪测定450 nm处的吸光度(A)值，并计算细胞存活率。细胞存活率(%)=(A药物组-A调零孔)/(A对照组-A调零孔)×100%。实验重复6次。

1.5.3 细胞形态学观察：取对数生长期SMMC-7721细胞，以每孔5×105个细胞/mL的密度接种于6孔板中，每孔体积2 mL，置于37℃，5% CO2细胞培养箱中培养。待细胞生长贴壁后，更换为含0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL茅苍术麸炒品培养基继续培养，24 h后于Olympus倒置显微镜下观察细胞形态的变化并采集图片。行Hoechst染色观察细胞凋亡情况，严格按照说明书进行操作，于倒置荧光显微镜观察细胞形态的变化并采集图片。

1.5.4 流式细胞术检测细胞的凋亡率：取对数生长期SMMC-7721细胞接种于6孔板中，密度为5×105个/mL，共2 mL，置于37℃，5% CO2细胞培养箱中培养。待细胞完全贴壁后，加入含0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL茅苍术麸炒品培养基，继续培养24 h后，应用流式细胞仪检测细胞凋亡，严格按照Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒说明书进行操作，计算细胞凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡之和)。实验重复3次。

1.6 体内实验

1.6.1 肝癌SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤模型的建立：取SMMC-7721细胞，调整细胞密度至5×107个细胞/mL，在无菌条件下用1 mL注射器吸取200 μL细胞悬液在每只裸鼠的近腋左背侧皮下进行皮下接种。待肿瘤体积达到100 mm3时，将裸鼠随机编号后从小到大依次编入模型组和茅苍术麸炒品低、中、高剂量组，每组6只，雌雄各半。低、中、高剂量组裸鼠分别每天灌胃(体积1 mL)0.8 g/kg、1.6 g/kg、3.2 g/kg的茅苍术麸炒品，模型组灌胃等体积的磷酸缓冲盐溶液，均1次/d，连续14 d。实验期间裸鼠自由饮食饮水，并观察裸鼠的一般生存状况。

1.6.2 抑瘤率的计算：末次给药24 h 后处死各组裸鼠，剥取肿瘤组织，称肿瘤质量，并计算抑瘤率[14]。抑瘤率(%)=(1-茅苍术麸炒品组平均肿瘤质量/模型组平均肿瘤质量)×100%。

1.6.3 免疫印迹试验检测肿瘤组织中相关蛋白的表达：末次给药24 h后处死各组裸鼠，剥取新鲜肿瘤组织称质量后，每20 mg加入RIPA 裂解液150 μL，提取总蛋白。用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。取蛋白样品 25 μg，经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后分离蛋白并转移至 PVDF 膜，用封闭液(5% BSA/TBST)封闭1 h，加 入 一 抗Bcl-2、Bax、Survivin和GAPDH(均1 ∶1 000) ，4℃孵育过夜，TBST 洗膜3次，加入二抗(1 ∶10 000)室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL系统显影。以GAPDH作为内参，Image J软件采集条带灰度值，取目的条带灰度值与内参条带灰度值比值作为目的蛋白相对表达量。

1.7 统计学分析 应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 茅苍术麸炒品对SMMC-7721细胞活性的影响 与0 μg/mL比较，100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL和600 μg/mL茅苍术麸炒品干预24 h后细胞的存活率均降低(均P<0.05)，而25 μg/mL和50 μg/mL茅苍术麸炒品干预后细胞的存活率与0 μg/mL干预差异无统计学意义(均P>0.05)；100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL和600 μg/mL茅苍术麸炒品干预后细胞存活率依次下降(均P<0.05)，见表1。因此，选取茅苍术麸炒品100、200和400 μg/mL进行后续实验。

表1 不同浓度茅苍术麸炒品干预下SMMC-7721细胞活性(x±s，%)

注：与0 μg/mL比较，*P<0.05；100～600 μg/mL各浓度两两比较，均P<0.05。

2.2 茅苍术麸炒品对SMMC-7721细胞形态的影响 0 μg/mL茅苍术麸炒品干预后的细胞排列紧密，呈梭形，形态饱满，边界清楚；而不同浓度茅苍术麸炒品干预后的细胞形态皱缩，贴壁差，细胞易脱落，且随着药物浓度的增加而加重，尤以400 μg/mL组明显，见图 1。Hoechst 33258 染色后可见， 0 μg/mL茅苍术麸炒品干预后的细胞形态一致，细胞核呈正常的蓝色，亮度均匀；不同浓度的茅苍术麸炒品作用后，细胞核固缩或呈碎裂块，并且颜色发白，生成凋亡小体，见图2。

图1 不同浓度茅苍术麸炒品干预后的SMMC-7721细胞形态(×200)

图2 不同浓度茅苍术麸炒品干预后SMMC-7721细胞的凋亡情况(Hoechst 33258荧光染色，×200)

2.3 茅苍术麸炒品对SMMC-7721细胞凋亡率的影响 与0 μg/mL比较，100 μg/mL、200 μg/mL和400 μg/mL茅苍术麸炒品作用24 h后细胞凋亡率均增加，且100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL茅苍术麸炒品干预后细胞凋亡率依次升高(均P<0.05)，见表2。

表2 不同浓度茅苍术麸炒品干预后SMMC-7721细胞凋亡率(x±s，%)

注：与0 μg/mL比较，*P<0.05；与100 μg/mL比较，#P<0.05；与200 μg/mL比较，▲P<0.05。

2.4 茅苍术麸炒品对SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤的抑制作用 与模型组比较，各剂量茅苍术麸炒品组裸鼠的肿瘤质量均降低(均P<0.05)，且茅苍术麸炒品低、中、高剂量组裸鼠的肿瘤质量依次降低(均P<0.05)，抑瘤率依次升高，见表 3。

表3 不同浓度茅苍术麸炒品干预后SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤质量及抑瘤率比较(x±s)

注：与模型组比较，*P<0.05；与茅苍术麸炒品低剂量组比较，#P<0.05；与茅苍术麸炒品中剂量组比较，▲P<0.05。

2.5 茅苍术麸炒品对SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤组织中相关蛋白表达的影响 与模型组比较，茅苍术麸炒品各剂量组的Bcl-2和Survivin蛋白的相对表达水平均降低，Bax蛋白的相对表达水平均升高(均P<0.05)；茅苍术麸炒品低、中、高剂量组裸鼠移植瘤的Bcl-2和Survivin蛋白的相对表达水平依次降低，Bax蛋白的相对表达水平依次升高(均P<0.05)。见图3及表4。

图3 不同浓度茅苍术麸炒品干预下SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤组织中Bcl-2、Survivin和Bax蛋白表达

表4 不同浓度茅苍术麸炒品干预下SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤组织相关蛋白的相对表达水平比较(x±s)

注：与模型组比较，*P<0.05；与茅苍术麸炒品低剂量组比较，#P<0.05；与茅苍术麸炒品中剂量组比较，▲P<0.05。

3 讨 论

茅苍术是一种普遍存在于自然界中的菊科植物，其性温而味辛、苦，可以治疗痛风、夜盲症、原发性高脂血症和膝关节骨关节病，还具有促进小肠蠕动、保肝、抗缺氧、抗菌抗病毒和降血糖等作用[10，15]。多项研究表明，茅苍术具有抑制动物移植性肿瘤、淋巴肉瘤、肺癌、食管癌和胃癌的生长，而这可能与其抑制细胞分裂，进而促进细胞凋亡形成凋亡小体等有关[6，11-12]。

本研究通过体内外实验分析茅苍术的抗肝癌作用。体外实验结果显示，100 μg/mL、200 μg/mL和400 μg/mL的茅苍术麸炒品干预后肝癌SMMC-7721细胞存活率均下降，提示其对肝癌SMMC-7721细胞增殖有抑制作用，且呈浓度依赖作用效应。为进一步研究茅苍术麸炒品药物干预后细胞凋亡和增殖的情况，本研究选取100、200和400 μg/mL浓度梯度进行后续的实验。

有文献报告，茅苍术通过丝裂原活化蛋白激酶激酶/细胞外调节蛋白激酶和核因子κB途径抑制非小细胞肺癌细胞系A549和NCI-H1299细胞增殖并诱导其凋亡，进而发挥抗肿瘤作用[11]。另一研究表明，茅苍术提取物能够抑制胃癌细胞的分裂分化，进而促进细胞凋亡[12]。本研究结果显示，经茅苍术麸炒品干预后，可以观察到肝癌SMMC-7721细胞形态皱缩，贴壁差，细胞极易脱落；Hoechst 33258 染色后可见，不同浓度的茅苍术麸炒品作用后细胞核固缩或呈碎裂块，并且颜色发白，生成凋亡小体；流式细胞术结果亦显示，不同剂量茅苍术麸炒品干预后肝癌SMMC-7721细胞凋亡率升高，且随药物浓度增大而依次增加(P<0.05)。这些结果与CCK-8实验结果一致，表明茅苍术麸炒品可以诱导肝癌细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。

茅苍术麸炒品体外抗肝癌实验结果显示，给药14 d后，各剂量茅苍术麸炒品组裸鼠的肿瘤质量均低于模型组，且随着药物浓度的增加肿瘤质量依次降低(均P<0.05)，抑瘤率依次升高，其中茅苍术麸炒品高剂量组的抑瘤率达到73.02%。

Bcl-2蛋白是凋亡研究中关键的癌基因之一[16]，其机制主要是调节线粒体外膜通透性，从而抑制细胞凋亡[17]。Bax是促进凋亡的蛋白，其过度表达可抵抗Bcl-2的保护效应而使细胞凋亡[18]。Survivin也是凋亡蛋白，其过表达与肿瘤细胞的分裂分化，促进肿瘤的发生密切相关[19]。研究表明，肝癌患者癌组织中Survivin mRNA和蛋白的表达均高于癌旁组织[20]。我们进一步取新鲜肿瘤组织检测凋亡相关蛋白的表达，实验结果显示各剂量茅苍术麸炒品组中Bcl-2和Survivin蛋白表达水平明显下调，Bax蛋白表达水平明显增加(均P<0.05)。因此，茅苍术麸炒品可能是通过下调肿瘤组织中Bcl-2和Survivin蛋白表达，上调Bax蛋白表达，从而抑制裸鼠移植瘤生长。

综上所述，茅苍术麸炒品能抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖并诱导其凋亡；同时茅苍术麸炒品能够抑制裸鼠移植瘤肿瘤的生长，其机制可能与其上调Bax蛋白表达和下调Bcl-2和Survivin蛋白表达有关。