LncRNA LUCAT1 在胰腺癌组织中的表达及其临床意义*

曹 维，朱 净，周国雄

（南通大学附属医院消化内科，江苏226001）

胰腺癌是高度侵袭性恶性肿瘤，超过80%胰腺癌在确诊时已是局部晚期或转移期[1]，5 年生存率仅3%[2]，中位生存时间 3～5 个月[3]。只有 10%～15%胰腺癌有机会手术切除[4]，但术后复发率高达75%～92%[5-6]。因此，发现有效的生物学标记对提高胰腺癌的诊断和治疗具有重要意义。

肺癌相关转录本1（lung cancer transcript 1，LUCAT1）是因为其通过抑制p21 和p57 表达促进非小细胞肺癌细胞增殖被首次发现而得名[7]，随后在膀胱癌、卵巢癌、非小细胞肺癌及肾透明细胞癌[8-9]等多种肿瘤中发现长链非编码RNA（LncRNA）LUCAT1的异常表达。本研究选取2012—2019 年我院普外经手术切除的80 例胰腺癌组织及其配对癌旁组织，分析胰腺癌组织LncRNA LUCAT1 的表达及其与临床病理参数的关系，探讨LncRNA LUCAT1 在胰腺癌发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 手术切除、病理证实的80 例胰腺癌组织及其配对癌旁组织，置液氮罐冻存。Trizol 试剂盒（美国 Invitrogen 公司），反转录试剂盒、MixPCR 扩增试剂盒（Fermentas 公司）。PCR 引物采用Primer5.0软件设计，由Invitrogen（上海）公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA 抽提：将组织剪成小碎块，放入研钵中加入液氮迅速反复研磨。取100 mg 组织加入1 mL Trizol 后转移至1.5 mL 无RNA 酶EP 管中。电动匀浆器充分匀浆1～2 min，室温静置5 min，12 000 r/min离心5 min，加入200 mL 氯仿充分混匀振荡后，12 000 r/min，4 ℃离心 5 min。吸取 400 μL 上层包含 RNA的水相，转移至新的EP 管中，加入500 μL 异丙醇充分混匀，于-20 ℃冰箱静置1h 以增加沉淀。1 2000 r/min，4 ℃离心15 min，弃上清保留沉淀，继续加入4 ℃预冷的75%无水乙醇1 mL，混匀后再次7 500 r/min，4 ℃离心5 min。 重复一次乙醇洗脱步骤，尽可能弃净上清。通风橱干燥5～10 min，待管壁乙醇完全挥发后加入25 μL DEPC 水，充分溶解管底RNA。

1.2.2 逆转录：取总 RNA 1 μg，5×PrimerScript RT Master Mix 4 μL，RNase Free dH2O 补充至总体积20 μL，设置逆转录条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 sec，4 ℃维持。

1.2.3 实时荧光定量PCR 检测：设计F 和R 引物，LncRNA-LUCAT1_F：GTGTCAAGCTCGGATTGCCT；R：GAGCCCACACACTCAGGTTC；GAPDH_F：CTGG GCTACACTGAGCACC；R：AAGTGGTCGTTGAGGG CAATG。SYBR-Green PCR Master mix 试剂盒中取SYBR Premix 12.5μL，Primer F 和 R（10 μmol/L）各1 μL，cDNA 2 μL×2，dH2O 8.5 μL，在 LightCycler 96 PCR 仪上，根据说明书设PCR 扩增的标准程序：预变性 95 ℃ 30 sec，PCR 反应 95 ℃ 5 sec，60 ℃ 30 sec，40 个循环，解离分析。GAPDH 作为参量，用2-ΔCT分析算得基因的相对表达量。

1.3 统计学处理 应用SPSS 22.0 统计学软件处理分析数据。等级资料组间比较采用秩和检验，分类变量资料组间比较采用χ2检验或Fisher 精确概率法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

胰腺癌组织中LncRNA LUCAT1 表达量高于配对的癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。有淋巴结转移、病理分期Ⅱ期以上以及有血管侵犯的胰腺癌组织中LncRNA LUCAT1 阳性表达率分别高于无淋巴结转移、病理分期为Ⅰ期以及无血管侵犯的胰腺癌组织，差异均有统计学意义（P＜0.05），LncRNA LUCAT1 阳性表达率与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤大小及肿瘤分化程度无关（P＞0.05）。见表1。

图1 胰腺癌组织与癌旁组织LUCAT1 表达

表1 LUCAT1 表达与临床病理参数关系 例（%）

3 讨 论

LncRNA 是一类长度大于200 个核苷酸的非编码RNA[10]，与DNA、RNA 和转录因子相互作用调控DNA 甲基化、组蛋白修饰及染色质重塑等多个生物学过程[11]，可影响控制细胞周期、血管生成，促进转录基因的表达[12]。在多种人类肿瘤中发现LncRNA表达的改变[13]，如卵巢癌细胞中LncRNA MALAT1表达与肿瘤大小、临床分期、转移及生存期相关[14]；非小细胞肺癌中LncRNA PRNCR1 高表达促进细胞内皮-间质转型（EMT），加速细胞迁移及侵袭进程。内源性的LncRNA DUXAP8 可以促进胰腺癌的增殖[15]；LncRNA SUMOP13 高表达促进胰腺癌的迁移、侵袭以及EMT 进程，提示LncRNA 在胰腺癌的发病中发挥重要作用[16]，它可能作为评判胰腺癌早期诊断、治疗和预后的生物学标记物[17]。

microRNA 作为小分子的非编码RNA，通过转录后调控的方式调节基因的表达，在肿瘤病理生理机制中发挥重要作用[18]。近年来研究发现，LncRNA与microRNA 相互作用形成在转录后水平调控基因的错综复杂的网络[19]，LncRNA 竞争性结合microRNA 与mRNA 的结合位点，抑制microRNA 与其它转录本的“分子海绵”或“分子诱饵”[20-21]。乳腺癌中miR-217 与LncRNA HOTAIR 结合，促进卵巢癌恶性增殖[22]。在肝癌中LncRNA linc00974 通过与miR-642 的相互作用调节KRT19 表达，并进一步影响NOTCH 和 TGF-β 信号通路[23]，从而更加证实LncRNA 与microRNA 的结合在肿瘤恶性增殖中发挥着重要作用。已有研究结果显示，miR-642 在前列腺癌、肝癌及膀胱癌[24]中发挥重要作用，胰腺癌miR-642 的表达与Ki67 表达相关[25]。本研究结果显示，胰腺癌组织中LncRNA LUCAT1 表达量高于癌旁组织，有淋巴结转移、病理分期Ⅱ期以上以及有血管侵犯的胰腺癌组织中LncRNA LUCAT1 阳性表达率增高，推测胰腺癌中LncRNA LUCAT1 可能通过竞争性结合miR-642 促进癌细胞的恶性增殖。