福氏志贺菌核酸适配体的SELEX筛选及特异性研究

冯俊丽 田小兰 汪 艺

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州310012）

志贺氏菌（Shigella）为一类具有高度传染性和危害严重的革兰氏阴性杆菌， 也是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通常称为痢疾杆菌[1]。 志贺氏菌常为食物爆发型或经水传播， 人类对志贺氏菌普遍易感，每年全球有1.6 亿人患病，约有110万人死亡， 绝大多数为5 岁以下儿童，10～100 CFU/mL 细菌即可致病[1-2]。 根据其抗原构造不同，志贺氏菌可分为4 个主要类群，即：痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍氏志贺菌和宋内氏志贺菌[3]。 在发展中国家， 由福氏志贺菌引起的感染性腹泻疾病高居首位，而发达国家主要为宋内氏志贺菌[3-4]。据报道， 历史上多次志贺氏菌的爆发与外来人口的突然涌入有关[5-6]。 由于10～100 CFU/mL 细菌即可致病，在人群密集区，志贺氏菌引起的痢疾爆发和传播速度很快并且难以控制[7]，亟需对志贺氏菌的快速、简单、准确和特异性高的检测方法。

我国自2005年开始，在全国范围内开展菌痢的监测， 志贺氏菌的报告病例数一直高居全国法定传染病的前5 位[1]。 目前，常用的志贺氏菌检测方法为生化培养法，包含富集、分离、纯化和鉴定等步骤， 通常需要将抽查样品带回实验室， 通过2～3 d 甚至更长时间才能完成整套检测，既费时费力又较繁琐[8]。 此外，志贺氏菌在人体外的存活力较差，只有小部分志贺氏菌可被检测。为了克服传统检测方法的局限，PCR、荧光定量PCR 及分子杂交技术已应用于志贺氏菌的检测[9-12]。 这些分子诊断技术虽具有敏感性及特异性强、 可大批量检测及避免主观偏差等优点， 部分解决了快速检测的需求， 但由于试验过程需要专业技术人员及PCR基因扩增仪、杂交仪等昂贵的仪器、设备而造成一定的局限性，在实际现场应用中还存在许多困难，难以在基层或者贫困地区推广[8]。建立简便、快捷、灵敏的可视化现场检测技术十分必要。

近年来， 基于核酸适配体技术的病原细菌分子检测方法逐渐出现，因其具有实时、快捷和可视化等优点而引起人们广泛关注[13-14]。核酸适配体是利用体外筛选SELEX 技术，从核酸分子文库中得到单链寡核苷酸序列。 它能够特异性地和靶物质结合， 具有与单克隆抗体相媲美的亲和力与特异性；与单抗相比核酸适配体还具有可体外筛选，靶分子范围广， 分子质量较低， 没有免疫源性和毒性，可通过化学合成制备、改造与标记，化学稳定性好等优点[15]。 目前，已筛选获得大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella）、金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）、 单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）和宋内氏志贺菌（S. sonnei）等的核酸适配体[4，16-20]。 然而，对于我国流行的福氏志贺菌（Sligella flexneri）还没有相关的报道。本研究利用福氏志贺菌S. flexneri ATCC 12022的全菌，进行SELEX 筛选，得到具有很高亲和力和特异性的福氏志贺菌单链DNA 适配子。本研究结果为食品中致病微生物的快速检测和鉴定提供了参考。

1 材料与方法

1.1 材料

福氏志贺菌（ATCC 12022）、大肠杆菌（ATCC 25922）、沙门氏菌（ATCC 15611）、金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、单增李斯特菌（ATCC 19112）、宋内氏志贺菌（S. sonnei ATCC 25931）、鲍氏志贺菌（S. boydii BNCC173713），购于广东省微生物研究所和北京北纳生物公司；pMD18-T 载体、JM109 感受态细胞、 高保真PCR 酶PrimeSTARRHS DNA Polymerase、50 bp DNA Ladder、 琼 脂糖，购于大连宝生物工程（Takara）有限公司；PCR清洁试剂盒， 购于杭州Axygen 生物技术有限公司；其它试剂为国产分析纯级。

1.2 适配体文库的构建和引物合成

81 nt 的适配体随机ssDNA 文库5 -AGTATACGTATTACCTGCAGC-N40-CGATATCTCGGAGATCTTGC-3 由上海生工生物工程有限公司合成。 其两端为固定序列，中间为40 个碱基的随机序列。 同时合成文库两端的固定序列作为SELEX筛选过程中PCR 的上下游引物， 即FP：5′-AGTATACGTATTACCTGCAGC -3′ ；RP：5′ -GCAAGATCTCCGAGATATCG-3′。 适配体文库和引物序列用TE 缓 冲液 （10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0）稀释到100 mol/L，-20 ℃保存备用。

1.3 适配体筛选过程

基于whole-bacteria SELEX 技术的筛选过程主要参考郝聚敏等[21]的试验方法。 具体如下：取新鲜培养的福氏志贺菌菌液1 mL （108～109CFU/mL），3 500 r/min 离心5 min 收集菌体， 沉淀用结合缓冲液 （0.85% NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）洗涤1 次后，重新悬浮于100 μL 结合缓冲液中。 取适配体文库30 μL （10 μmol/L），85 ℃变性5 min、冰浴10 min 后，加入到菌悬液中，30 ℃与菌体结合1 h。 结合反应结束后，3 500 r/min 离心5 min 收集沉淀，随后沉淀用结合缓冲液清洗2 次；然后在沉淀中加入100 μL TE 缓冲液， 并于85℃加热5 min，冰浴10 min，使适配体序列与菌体分离。 最后经15 000 r/min 离心10 min，收集含适配体序列的上清液。

以上述上清液为模板进行不对称PCR 扩增，反应体系为：2 μL 模板，10 μL 2 PrimeSTAR Max Premix （Takara），1 μL 上游引物（10 μmol/L），0.2 μL 下游引物（1 μmol/L），6.8 μL ddH2O。热循环参数为： 98 ℃10 s，58 ℃10 s，72 ℃10 s，35 个循环。

PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，作为ss-DNA 文库接着用于下一轮的SELEX 筛选。 为提高适配体筛选的特异性， 每2 轮正筛后进行1 轮反筛， 即分别在第3，6，9，12，15，18 轮用大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、宋内氏志贺菌和鲍氏志贺菌进行反向筛选。 反筛过程与正筛基本相同，但在结合反应结束后，离心收集不与反筛菌结合的上清液， 直接作为模板进行随后的不对称PCR 扩增步骤。

1.4 适配体的测序分析及二级结构模拟

以20 轮筛选得到的ssDNA 产物为模板，利用上下游引物进行普通PCR 扩增。 扩增产物经PCR 清洁试剂盒（Axygen）纯化后，与pMD18-T 载体相连。 连接反应体系为：pMD18-T Vector（50 ng/μL）1.0 μL，PCR 产物 （约100 ng/μL）1.0 μL，Solution I 5.0 μL，ddH2O 3.0 μL； 反应条件为16℃30 min。

将全部连接产物 （10 μL）加入至100 μL JM109 感受态细胞中，冰中放置30 min。 42 ℃热激45 s 后，再在冰中放置1 min。加入890 μL SOC培养基，37 ℃振荡培养60 min。 取200 μL 菌液涂布于含X-Gal （20 mg/mL）、IPTG （200 mg/mL）、Amp（20 μg/mL）的LB-琼脂平板培养基上，正面放置20 min 后，37 ℃倒置培养12～14 h。 挑选白色单菌落， 于1 mL 含Amp 的LB 液体培养基中（l.5 mL 离心管中）37 ℃摇床培养14 h。 取0.5 μL 菌液直接PCR 法确认载体中插入片段的大小。 随机挑选30 个阳性克隆，送上海英骏生物技术有限公司测序。测序获得的序列及其结构用DNAMAN 软件进行比对分析， 并利用在线程序Mfold （http：//mfold.rna.albany.edu/?q=mfold）进行预测和模拟。

1.5 适配体的亲和特异性考察

选择并合成测序过程中出现频率较高的适配子序列， 利用地高辛-抗地高辛抗体-过氧化物酶显色反应考察其与福氏志贺菌结合的特异性。 具体如下： 合成高频适配体序列并对其5′端进行地高辛标记（上海生工）。然后按照正筛的操作步骤，取地高辛标记的适配体序列10 pmol， 分别与1 mL 待测菌液（约108CFU/mL）结合1 h。 离心收集菌体并清洗2 次，沉淀中加入100 μL 辣根过氧化物酶标记的兔抗地高辛抗体IgG∶HRP（1 ∶1 000），反应10 min 后离心弃上清。 清洗沉淀3 次，加入100 μL TE 缓冲液重悬沉淀，并加入200 L 新配的显色底物 （1 mg/mL TMB：底物缓冲液：30%H2O2=100 ∶900 ∶1）。 避光反应10 min 后，加入50 μL 2 mol/L H2SO4终止反应， 然后测得各个反应管在450 nm 的吸光度值A450。 各个待测菌同时做一个不加适配体的空白对照。另外，各适配体设置阳性对照组， 即不加菌液直接以各适配体（10 pmol）进行地高辛-抗地高辛抗体-过氧化物酶显色反应。该试验共重复3 次，相对亲和力=［A450（试验组平均值）-A450（对照组平均值）］/A450（阳性对照组平均值）。

1.6 适配体亲和常数考察

各适配体与福氏志贺菌的亲和常数测定方法如下：将福氏志贺菌（约108CFU/L）分别于不同浓度的适配体序列 （10，50，100，150，200，250 nmol/L）结合1 h，然后按照1.5 节的方法计算不同浓度时的亲和力，并以适配体浓度为横坐标，亲和力为纵坐标作图。 通过Origin 8.0 软件拟合每一条适配体的饱和结合曲线，并计算其解离常数Kd值。

2 结果与分析

2.1 SELEX 筛选得到的适配子的克隆及序列分析

经过14 轮正筛和6 轮反筛之后， 随机挑选30 个克隆进行测序分析。 测序结果显示，共得到17 条序列（表1）。 其中有4 个适配子的序列（F1、F3、F9 和F16）在测序结果中出现2 次以上，是高频适配子。

表1 SELEX 筛选得到的核酸适配体序列Table 1 Aptamer candidates obtained after SELEX selection

2.2 适配子的亲和特异性验证

由于测序是随机挑取克隆进行的， 因此在测序结果中高频出现的适配子， 其在富集库中所占的比率也可能较高。 本研究对选取出来的4 个高频适配子进行亲和特异性分析。根据图1 可知，这4 个高频适配子对福氏志贺菌的亲和力均显著高于其它菌，呈现较好的亲和特异性。 但比较而言，F-1 和F-9 对福氏志贺菌的亲和力明显较高，而且与宋内氏志贺菌和鲍氏志贺菌的交叉反应也更小。因此，后续只选F-1 和F-9 适配子进行亲和常数的测定。

图1 适配体F-1, F-3, F-9 和F-16 与福氏志贺菌的亲和力和亲和特异性分析Fig.1 Analysis the affinities and binding specific of aptamer F-1, F-3, F-9 and F-16 to S. flexneri

2.3 适配子的亲和常数及其二级结构预测

对F-1 和F-9 适配子进行了亲和常数的测定， 其中适配子F-1 的亲和常数饱和曲线如图2,拟合系数R2=0.979，呈较好的拟合效果，适配子与菌体之间的亲和常数Kd=（51.3±3.25）nmol/L。适配子F-9 的饱和曲线与图2 类似，亲和常数Kd=（42.6±7.11）nmol/L。 根据亲和常数越小，适配体与靶标的亲和力越大的原则， 适配子F-9 对福氏志贺菌的亲和力更大，这与图1 的结果基本一致。

利用在线软件DNA Mfold version 3.6， 适配子F-1 和F-9 的二级结构如图3 所示， 两者明显不同，最小自由能（dG）分别为-7.39 kcal/mol和-6.98 kcal/mol， 该结果表明筛选得到的适配体结构比较稳定。另外，从适配子F-1 和F-9 的二级结构图中还可发现，F-9 的二级结构明显较F-1复杂，该特点可能与其较高的亲和力有一定关系。

3 讨论

图2 适配体F-1 与福氏志贺菌结合的亲和常数饱和曲线Fig.2 The binding saturation curve of aptamer F-1 to S. flexner

近年来， 分子生物学的发展为食品安全快速检测提供了良好的技术平台[22-23]。 然而，由于食品基质成分复杂，基于PCR 和ELISA 的检测方法常常会出现假阳性或假阴性的结果[24-25]。 而且，这些检测技术需要在实验室中借助特殊的仪器来完成，不能满足监管部门同时对大批食品样品快速、高通量的检测需求[26]。 适配体技术无需对待测样品进行富集和培养，也无需裂解提取DNA，而且相比抗体适配体的化学结构更稳定、 分子质量更小，无需实验动物，可通过人工合成大量制备[27]。因而， 在微生物的检测鉴定中体现了较好的应用前景。 本研究采用SELEX 技术首次筛选出了福氏志贺菌的适配子，亲和特异性研究显示，这些适配子不仅能用于区分福氏志贺菌与其它常见食源性致病菌如大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌， 还可用于区分同属的宋内氏志贺菌和鲍氏志贺菌， 这为后续应用适配子对福氏志贺菌进行检测鉴定奠定了较好的基础。

图3 适配体F-1 和F-9 的二级结构预测Fig.3 Predicted secondary structure of aptamer F-1 and F-9

在致病菌的适配体筛选过程中， 一种是以菌体表面分子为靶标进行的。 这种筛选过程通常需要将细菌灭活，再分离纯化出菌体表面的蛋白质、多糖等大分子， 并以其作为靶标进行SELEX 筛选。但是，由于分离纯化过程中可能改变了菌体表面大分子的空间构型， 常常导致得到的适配体在实际致病菌的检测过程中效率降低或完全不适用[28]。 本研究采用以福氏志贺菌全菌为靶标，不仅简化了筛选过程， 还最大限度地保持菌体的自然状态和表面分子的天然结构， 有利于对实际食品样品的检测。

有文献报道认为在不同条件下培养得到的细菌，其菌体状态会存在差别[20]。 并且由于细胞壁及细胞荚膜的存在， 适配体很难直接与菌体表面的蛋白或多糖等大分子接触[28]。 因此，全细胞的适配体筛选的确存在更多困难。 本研究严格控制不同批次福氏志贺菌的培养条件和时间， 并通过吸光光度计对活菌数目进行定量， 光学显微镜检测和表征其生长状态，尽量减少活菌靶标的性状差异，提高了检测的重现性。

亲和常数（Kd）是衡量适配体与其靶标结合效率的主要指标。亲和常数越低，对靶标的亲和能力越高。 已有的研究显示，大部分细胞、细菌等复杂大分子与适配子的亲和常数都在nmol/L 数量级[29-30]。 本研究中，适配体F-1 和F-8 的Kd值分别为（51.3±3.25）nmol/L 和（62.6±7.11）nmol/L。 该结果与文献报道基本一致， 表明其与靶标的亲和力较高。

目前， 食源性疾病已成为影响公共健康的重要因素。 严格的微生物检验是保障食品安全的重要环节。 适配体对靶细胞可特异性识别且结合力很强，可与磁珠等结合抓取复杂基质中的靶标，并且作为一类分子识别元件易于搭载各种传感元件组建不同类型的生物传感器， 能满足当下对食品中可能存在的食源性致病菌的现场检测要求[13-14，26]。本研究初步筛选出来2 条针对福氏志贺菌全菌的适配体， 但该适配体与靶细胞特异性结合的分子机制尚未阐明。 在后续研究中我们将进一步深入研究适配体与致病菌的亲和作用机制， 结合高灵敏度的传感器技术， 建立食品中福氏志贺菌的高效快速检测方法。

4 结论

本研究成功构建了随机寡核苷酸文库及相应引物，以福氏志贺菌活菌细胞为靶标，利用SELEX技术经过20 轮筛选富集，得到了一组适配体序列进行亲和力和特异性考察。 最终， 适配体F-1 和F-9 表现出与福氏志贺菌较高的亲和能力和亲和特异性， 可进一步应用于检测食品中的福氏志贺菌的检测。 该研究结果为食源性致病菌快速检测提供了新思路。