玉郎伞查尔酮激活Nrf2/ARE信号通路减轻缺氧/复氧所致的H9c2细胞凋亡及氧化应激损伤

覃斐章，董 敏，秦秋华，禤霏霏，黄媛恒

1广西医科大学，南宁 530021；2南宁市第二人民医院，南宁 530031

缺血心脏在恢复血流灌注后损伤进一步加重的现象，称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)，常见于心脏移植、急性冠脉综合征和冠脉搭桥术后。MIRI时产生的大量自由基尤其是活性氧(ROS)不仅能直接损伤脂质、蛋白质和核酸，还能与NO、脂肪酸、Fe2+反应生成毒性物质，如ONOO-、OH-等间接损伤细胞。氧化应激水平的升高，还能激活凋亡相关蛋白，使凋亡细胞增多，与心血管重构及心力衰竭早期心肌梗死的发生密切相关[1]。

Nrf2/ARE(Nuclear factor erythroid derived 2 related factor 2/Antioxidant response element)信号通路是体内重要的抗氧化通路，在MIRI的治疗中发挥着重要的作用。Nrf2已被证实广泛分布于心脏和血管系统[2]。有研究表明，活化的Nrf2可以促进抗氧化酶的表达，清除过量的ROS，降低氧化应激诱导的心肌细胞凋亡[3]。用Nrf2 siRNA沉默其表达后，对缺氧/复氧的心肌细胞的保护作用明显减弱甚至消失，说明Nrf2的活化对心肌细胞的保护具有十分重要的作用[4]。增强Nrf2活性，还能有效的减轻糖尿病小鼠的心肌损害，延缓缺氧诱导的心肌纤维化的发展[5]。

1 材料与方法

1.1 细胞

H9c2 心肌细胞系购自中国科学院上海细胞库。

1.2 试剂与仪器

试剂：YLSC(由广西医科大学药理教研室提供，HPLC显示其纯度为98%)；ML385购自美国AbMole公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；MTT和胰酶购自美国Amresco公司；ROS 检测试剂盒及Annexin V-FITC/PI 双染色流式细胞凋亡检测试剂盒购自美国Invitrogen公司；细胞核蛋白和细胞浆蛋白抽提试剂盒购自上海碧云天公司；Western blot 一抗Cleaved caspase 3、Bax、Bcl-2、Nuclear-Nrf2、HO-1、β-actin、lamin B购自美国Santa Cruz 公司；Western blot二抗购自北京中杉金桥公司；考马斯亮蓝蛋白质定量试剂盒、LDH、GSH-Px、MDA、SOD测试盒购自南京建成生物工程研究所。

仪器：722S型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；Multiskan FC酶标仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；FACSCanto II流式细胞仪，美国BD 公司；伯乐电泳仪，美国Bio-Rad 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 造模及分组

模型的建立参考文献[10]。将细胞分正常组、模型组、YLSC低剂量组、YLSC中剂量组、YLSC高剂量组、YLSC高剂量+ML385组。正常组H9c2细胞用含10%胎牛血清的DMED培养液在37 ℃ CO2培养箱中培养，不经任何处理。模型组H9c2细胞使用无血清的DMEM培养液，并置于缺氧盒(94% N2+5% CO2+1% O2)中培养12 h，随后更换正常培养液并置于37 ℃ CO2培养箱(95%空气+5%)中培养24 h，复制心肌细胞缺氧/复氧模型。YLSC低、中、高剂量组细胞分别给予终浓度为75、150、300 μg/mL的YLSC孵育24 h，然后进行缺氧/复氧处理。YLSC高剂量+ML385组细胞先给予3 μg/L ML385培育30 min，再加入300 μg/mL YLSC孵育24 h，然后进行缺氧/复氧处理。

1.3.2 细胞存活率测定

将细胞以6 ×104个/mL密度接种于96孔板。MTT法测定细胞存活率。每孔加入浓度为5 mg/mL 的MTT 20 μL，在37 ℃培养箱中培育4 h。弃上清液后，每孔加入100 μL DMSO溶解甲结晶。用酶标仪在570 nm处测定吸光度(A)值。按以下公式计算细胞存活率。

细胞存活率=(实验组A值/对照组A值)×

100 %

1.3.3 细胞上清液LDH检测

实验结束后，收集培养液，3 000 rpm 离心10 min，取上清液备用。按试剂盒说明书测定细胞上清液LDH含量。

1.3.4 细胞匀浆SOD、MDA、GSH-Px检测

加入适量胰酶消化细胞，1 000 rpm离心10 min，弃上清，加入1 mL PBS，1 000 rpm离心10 min，重复2～3次。在细胞沉淀中加入0.5 mL PBS溶液，重悬并混匀，在超声条件下破裂细胞，每次1～2秒，重复10次，取破碎好的匀浆液进行测定。按试剂盒说明书测定细胞匀浆SOD、MDA、GSH-Px活性。

1.3.5 心肌细胞凋亡率检测

经药物或缺氧/复氧预处理后，胰酶消化细胞，PBS清洗两次，2 000 rpm离心5 min，收集1×105个心肌细胞。加入100 μL Binding Buffer 重悬细胞，随后加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混匀，室温避光反应15 min。1 h 内利用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率。

1.3.6 心肌细胞 ROS检测

按照试剂盒说明书测定细胞内ROS水平。消化并收集1×105个细胞，置于含血清培养基的离心管中，1 500 rpm 离心5 min。用预冷的 PBS 清洗两次。加入0.1 μM 的 Dihydroethidium染料500 μL，吹打均匀，37 ℃避光孵育 30 min，过滤收集，利用流式细胞仪检测细胞 ROS含量。实验结果以平均荧光强度表示。

1.3.7 Nuclear-Nrf2、HO-1、Cleaved caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表达测定

抽提细胞蛋白，并用BCA法进行蛋白定量。取30 μg蛋白上样量，12% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，恒定电压转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h。随后加入相应一抗(Nuclear-Nrf2 1∶1 000；HO-1 1∶500；β-actin 1∶200；Lamin B 1∶400；Cleaved caspase 3 1∶500；Bax 1∶400；Bcl-2 1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次后，加入二抗37 ℃孵育2 h，ECL发光，X线片显影、定影，Image J software分析其条带灰度值。

1.3.8 统计学处理

应用SPSS 21.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，多个样本均数间的两两比较采用SNK-q检验，P<0.05时被认为有统计学差异。

2 结果

2.1 YLSC对细胞存活率和上清液LDH含量的影响

与正常组比较，模型组心肌细胞存活率明显下降，细胞上清液中LDH含量明显升高(P<0.01)；与模型组比较，不同剂量YLSC预处理后，心肌细胞存活率明显提高，上清液LDH水平明显降低，并呈剂量依赖关系(P<0.05或P<0.01)。与YLSC-H组比较，YLSC-H+ML385组细胞存活率明显下降，上清液LDH水平明显升高(P<0.01)，结果见表1。

表1 YLSC对细胞存活率和上清液LDH水平的影响

注：与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与YLSC-H组比较，&P<0.05，&&P<0.01，下同。

Note:Compared with normal group,##P<0.01;Compared with model group,*P<0.05,**P<0.01;Compared with YLSC-H group,&P<0.05,&&P<0.01,the same below.

2.2 YLSC对细胞ROS和胞浆SOD、MDA及GSH-Px含量的影响

与正常组相比，模型组细胞ROS及MDA含量明显升高(P<0.01)，SOD和GSH-Px含量明显降低(P<0.01)；与模型组相比，YLSC能明显降低ROS及MDA含量，升高SOD、GSH-Px水平，呈剂量依赖关系(P<0.05或P<0.01)。与YLSC-H组比较，YLSC-H+ML385组细胞ROS和MDA含量明显升高，SOD和GSH-Px含量明显降低(P<0.05或P<0.01)，结果见表2。

表2 YLSC对细胞ROS和胞浆SOD、MDA、GSH-Px含量的影响

续表2(Continued Tab.2)

组别Group活性氧ROS平均荧光强度丙二醛MDA(nmol/mgprot)超氧化物歧化酶SOD(U/μgprot)谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px(U/μgprot)YLSC中剂量YLSC-M88.53±6.67∗∗9.86±0.80∗0.141±0.011∗∗0.710±0.050∗∗YLSC高剂量YLSC-H72.46±5.18∗∗9.35±0.73∗0.146±0.028∗∗0.715±0.081∗∗YLSC高剂量+ML385YLSC-H+ML38593.25±10.72&&10.50±1.19&0.126±0.014&0.611±0.058&

图1 YLSC对H9c2细胞凋亡率的影响

2.3 YLSC对细胞凋亡率的影响

与正常组比较，模型组能明显增加细胞凋亡率(P<0.01)。与模型组比较，75、150、300 μg/mL的YLSC预处理可使细胞凋亡率逐渐下降(P<0.05或P<0.01)。与YLSC-H组比较，YLSC-H+ML385组细胞凋亡率明显增加(P<0.05)，结果见图1。

2.4 YLSC对心肌细胞缺氧/复氧Cleaved caspase 3、Bcl-2及Bax 蛋白表达量的影响

与正常组比较，模型组细胞Bcl-2表达明显下调(P<0.01)，Cleaved caspase 3和Bax表达明显上调(P<0.01)；与模型组比较，YLSC组Bcl-2表达水平升高，而Cleaved caspase 3和Bax表达水平降低(P<0.05或P<0.01)，呈剂量依赖关系。与YLSC-H组比较，YLSC-H+ML385组细胞Bcl-2表达明显下调，Cleaved caspase 3和Bax表达明显上调(P<0.05或P<0.01)，结果见图2。

图2 YLSC对H9c2细胞Cleaved caspase 3、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

2.5 YLSC对心肌细胞缺氧/复氧Nuclear-Nrf2HO-1蛋白表达的影响

与正常组比较，缺氧/复氧增加了细胞Nrf2核转移和HO-1的表达(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较，YLSC处理后使得Nrf2核转移和HO-1的表达进一步增加，并呈剂量依赖关系(P<0.01)。与YLSC-H组比较，YLSC-H+ML385组Nrf2和HO-1的蛋白表达水平明显降低(P<0.01)，结果见图3。

图3 YLSC对H9c2细胞Nuclear-Nrf2、HO-1蛋白表达的影响

3 讨论

缺血再灌注使细胞活性降低，数量减少，凋亡细胞增多，最终导致心功能障碍。线粒体在调控细胞凋亡上起着重要的作用。线粒体功能下降是细胞凋亡的早期表现，伴随着线粒体膜电位的下降[11]。Bcl-2能维持线粒体的完整性，而Bax则能增加线粒体转换孔的通透性，使AIF和Cyt c从线粒体释放增加。Caspase 3是Caspase家族的下游蛋白，可导致细胞内DNA断裂，最终引起细胞凋亡。本实验用流式细胞仪检测H9c2细胞的凋亡率，发现 YLSC能减少缺氧心肌细胞的凋亡率，使Bcl-2的表达升高，而Bax和Cleaved caspase 3的表达明显降低。提示YLSC具有减轻心肌细胞凋亡的作用。

大量研究表明，Nrf2是调节细胞内氧化还原反应的关键转录因子。它可使抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶(如NQO1、谷胱甘肽、GSH-Px、SOD等)表达上调，以减轻氧化应激反应[12]。Nrf2信号通路亦可调节线粒体的生物合成和NADPH氧化酶影响细胞内ROS的生成[13]。正常情况下，Nrf2与Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1)相连，并被Keap1阻止活性。当细胞受到氧化应激源作用或其它刺激时，Keap1半胱氨酸残基被修饰，构象发生改变，Nrf2-Keap1复合物解离，Nrf2快速由细胞质转入细胞核。入核的Nrf2与ARE结合，促进下游的目标基因如γ-glutamylcysteine synthetase、hemeoxygenase 1(HO-1)等的表达[14]。Xu等[15]研究发现，Nrf2基因敲除小鼠心肌梗死面积增加，心脏保护作用减弱。Triptolide减少缺血再灌注引起的炎症反应和氧化应激，机制与上调Nrf2和HO-1蛋白表达有关[16]。Nrf2还参与了凋亡的调节。Das[17]等报道，Nrf2/ARE信号通路通过影响p53、Bax、Bcl-2、Bad、Caspase 3等线粒体依赖的凋亡蛋白影响细胞的生存。介导Nrf2活性的蛋白Keap1，可以与Bcl-2相互作用，调控细胞的凋亡[18]。本实验发现，缺氧/复氧能使心肌细胞HO-1表达增加，Nrf2在细胞核表达增多。YLSC预处理24 h后，HO-1和细胞核内Nrf2表达进一步增加，同时细胞凋亡率和凋亡相关蛋白表达减少，抗氧化酶表达增加。同时给予Nrf2抑制剂ML385后，可见细胞的凋亡率增加，抗氧化水平降低，Nrf2和HO-1的上调受到抑制，提示YLSC的抗氧化应激和细胞凋亡的作用可能与Nrf2/ARE信号通路有关。有研究发现，PI3K/Akt/GSK3β信号通路作为Nrf2的上游通路也参与了Nrf2的调控[19]。GSK3β能直接磷酸化Nrf2，通过Fyn激酶促进Nrf2核转录，并使Nrf2在细胞核中失活[20]。我们前期的研究发现，YLSC能激活PI3K/Akt信号通路，减轻缺血再灌注诱导的心肌细胞自噬和凋亡[21]。PI3K/Akt信号通路是否参与了YLSC介导的Nrf2调节，在抗氧化反应和阻止缺血诱导的细胞凋亡方面发挥作用，有待于进一步研究。

综上所述，YLSC预处理对H9c2细胞缺氧/复氧损伤有保护作用，能够显著降低LDH水平和细胞凋亡率，增加SOD、GSH-Px含量，降低MDA、ROS 水平。增加Nuclear-Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达，减少Bax和Cleaved caspase 3蛋白表达，其机制可能与激活Nrf2/ARE 信号通路有关。