黔产徐长卿根茎化学成分及抗烟草花叶病毒活性

唐 攀，陈 洁，晏 英,，胡嘉琪，徐 冉,，张吉泉,，汤 磊,*

1贵州医科大学药学院，贵阳 550025；2贵州医科大学 贵州省化学合成药物研发利用工程技术研究中心，贵阳 550004

徐长卿Cynanchumpaniculatum(Bunge)Kitagawa为萝摩科鹅绒藤属多年生草本植物，其干燥根和根茎入药，味辛、性温，归肝、肾经，具有祛风化湿、止痛止痒的功能，用于治疗风湿痹痛、胃痛胀满、牙痛、腰痛、跌打伤痛、风疹、湿疹等症[1]。全世界约有萝摩科植物180属，2 200种，分布于世界热带、亚热带和少数温带地区。我国约有44属、245种、33变种，分布于西南及东南部以及少数西北与东北各省区。其主要成分丹皮酚具有抗炎镇痛、抗病毒、抗菌、抗蛇毒、免疫调节、抗肿瘤、保护心血管等作用[2]。临床应用广泛，已开发的徐长卿注射液用于镇痛、消炎及类风湿性关节炎[3]，复方徐长卿洗剂联合西药用于各型湿疹的临床治疗[4]，复方徐长卿合剂作鼻腔冲洗，治疗常年性变态性鼻炎[5]。研究发现，从徐长卿中分离得到的一系列seco-pregnane类C21甾体化合物具有很强的抗烟草花叶病毒(TMV)活性，该类化合物能高选择性地抑制TMV亚基因组RNA的表达，而对病毒基因组RNA没有影响，同时，化合物还能明显抑制TMV的长距离移动[6]，说明该类C21甾体化合物对TMV新颖的作用机制为抗病毒制剂研究带来新的机遇。为了继续寻找具有抗TMV活性的化学成分，我们对黔产徐长卿根茎的化学成分进行了研究，并对化合物进行了抗TMV活性测试。

1 仪器与材料

旋转蒸发仪(东京理化，N-1300D-WD)，Bruker AV-600 MHz 核磁共振仪(德国布鲁克公司)；四甲基硅烷(TMS)为内标；Bruker HTC/Esquire 质谱仪(德国布鲁克公司)；高效液相色谱仪为Agilent 1200型(美国安捷伦科技司)；色谱柱Waters sunfire C18(10 × 150 mm，4.6 × 250 mm)(沃特世公司)；BP211D电子天平(Sartorouius公司)；高速冷冻离心机(2K15型，德国Sigma公司)，酶标仪(美国BIOTEK公司)，Sephadex LH-20(三菱公司)；C18反相硅胶(日本 YMC 公司)；正相硅胶和薄层色谱板(青岛海洋化工厂)；核磁用氘代试剂(美国CIL氘代试剂)；液相用水(娃哈哈纯净水20181109)；色谱级甲醇、乙腈(科密欧试剂公司)；化学实验用溶剂为工业重蒸溶剂，显色剂为8%的硫酸乙醇溶液。

供试毒源：TMV(U1)普通株系，购于中国科学院武汉病毒研究所。保存于-20 ℃，临用时取出用0.01 M PB稀释至50 μg/mL。供试寄主：心叶烟(Nicotianaglutinosa)，为TMV枯斑寄主，普通烟K326(NicotianatabacumK326)，温室中繁育，种子均购于中国农业科学院烟草研究所。

样品采自贵州省黔东南州，经过贵阳中医学院孙庆文老师鉴定为徐长卿Cynanchumpaniculatum，凭证标本(XCQ201809)保存于贵州医科大学药学实验室。

2 实验方法

2.1 化合物提取与分离

干燥徐长卿根茎50 kg，用90%的乙醇回流提取3次，提取温度为每次时间为3 h，浓缩回收酒精得粗提物约10 kg，加水混溶成浑浊液体，分别用石油醚、乙酸乙酯等体积萃取3次，回收乙酸乙酯得浸膏2.130 kg。乙酸乙酯部分经过硅胶柱层析，用石油醚/丙酮(30∶1→0∶1)快速梯度洗脱得到Fr1～Fr6 共6个部分，其中Fr2(56g)以石油醚醚/丙酮(10∶1～5∶1)梯度洗脱，分成3个亚部分Fr2-1～Fr2-3，Fr2-1反复经过通过凝胶柱层析(甲醇)得化合物11(51.7 mg)，Fr2-2经过凝胶柱层析(甲醇)后再通过硅胶柱层析以石油醚醚/丙酮(7∶1)洗脱得到化合物12(29.6 mg)和13(19.5 mg)；Fr3(130 g)再次以二氯甲烷/甲醇(30∶1～5∶1)梯度洗脱，分成4个亚部分，分别为Fr3-1～Fr3-4。其中 Fr3-2经过反相柱层析洗脱(甲醇∶水= 75∶25)得化合物1(15mg)，再经过硅胶柱层析(石油醚/丙酮=5∶1)及高效液相色谱色谱 HPLC分离(流动相为甲醇∶水= 80∶20，流速为3 mL/min)得化合物3(12.2 mg)和4(9.8 mg)；Fr3-3通过凝胶柱层析(氯仿∶甲醇= 1∶1)得化合物2(23.1 mg)，Fr3-4经过反相柱层析洗脱(甲醇∶水= 65∶35)，再经过高效液相色谱色谱HPLC制备分离(流动相为甲醇∶水= 80%∶20%，流速为3 mL/min)得化合物7(15.3 mg)和8(7.2 mg)；Fr3-1通过凝胶柱层析(纯甲醇)再经过硅胶柱层析(石油醚/丙酮=8∶1)得化合物9(10.5 mg)；Fr4(310 g)经过二氯甲烷/甲醇(30∶1→5∶1)梯度洗脱，再用反相硅胶柱层析(甲醇∶水= 60∶40)洗脱分成Fr4-1～Fr4-6部分，Fr4-6再通过凝胶柱层析(纯甲醇)及高效液相色谱(流动相为甲醇∶水=75∶25，流速为3 mL/min)制备分离纯化，得到化合物5(11.9 mg)；Fr4-5再经过高效液相色谱(流动相为甲醇∶水=75∶25，流速为3 mL/min)制备分离纯化得到化合物6(6.8 mg)和10(16.7 mg)。

2.2 化合物活性筛选

2.2.1 化合物对TMV的钝化作用实验

挑选健康长势一致的5～6叶期的心叶烟，暗室放置一夜。将供试化合物与50 μg/mL的TMV 1∶1(V∶V)混合至所需浓度，混匀放置0.5 h。每棵烟挑选大小相似的4～6片叶子，每片叶子的一半摩擦接种化合物与TMV的混合溶液100 μL作为处理；另一半摩擦接种50 μg/mL TMV100 μL作为阳性对照；摩擦接种相应浓度DMSO溶液的叶片作为空白。2 h后用无菌水将叶表面的金刚砂洗净。放入无虫温室中，3～4天后按公式计算TMV抑制率=[1-(处理的平均枯斑数/阳性对照的平均枯斑数)]×100%[7]，每个化合物重复三次。

2.2.2 化合物对烟草的保护作用实验

挑选健康长势一致的5～6叶期的心叶烟，暗室放置一夜。每棵烟挑选大小相似的4～6片叶子，供试化合物用无菌水稀释为所需浓度，每片叶子的一半均匀施药100 μL作为处理，24 h后每片叶子摩擦接种50 μg/mL TMV 200 μL，未施药的一半作为阳性对照，未施药且摩擦接种相应浓度DMSO溶液的叶片作为空白。2 h后用无菌水将叶表面的金刚砂洗净。放入无虫温室中，3～4天后按公式计算TMV抑制率=[1-(处理的平均枯斑数/阳性对照的平均枯斑数)]×100%，每个化合物重复三次。

2.2.3 化合物对烟草的治疗作用实验

挑选健康长势一致的5～6叶期的心叶烟，暗室放置一夜。每棵烟挑选大小相似的4～6片叶子摩擦接种50 μg/mL TMV 200 μL，2h后每片叶子的一半均匀施药100 μL作为处理；另一半作为阳性对照；未施药且摩擦接种相应浓度DMSO溶液的叶片作为空白。2 h后用无菌水将叶表面的金刚砂洗净。放入无虫温室中，3～4天后按公式计算TMV抑制率=[1-(处理的平均枯斑数/阳性对照的平均枯斑数)]×100%，每个化合物重复三次。

2.2.4 离体叶圆片法

挑选健康合适的普通烟，暗室放置一夜。每棵烟挑选大小相似的3片叶子，每片叶子摩擦接种0.032 μg/μL TMV 200 μL，10 min后用无菌水冲洗干净。6 h后将叶片切成直径1 cm的圆片，取20片浸入供试化合物溶液中作为处理；另20片浸入25 μL/mL DMSO溶液中作为阳性对照；只摩擦未接种的20片浸入25 μL/mL DMSO溶液中作为空白。放入28 ℃光照培养箱中培养，48 h后进行TAS-ELISA，测定OD405值，根据TMV病毒标准曲线计算TMV浓度，按公式计算TMV抑制率=[1-(处理的TMV浓度/阳性对照的TMV浓度)]×100%[8]，每个化合物重复三次。

3 实验结果

3.1 结构鉴定

化合物1白色粉末；ESI-MS：m/z399[M +Na]+，确定分子质量376；分子式C21H28O6；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.28(1H，s，H-18)，5.46(1H，d，J= 6.0 Hz，H-6)，5.33(1H，m，H-16)，4.17(1H，t，J= 6.0 Hz，H-15β)，3.86(1H，t，J= 6.0 Hz，H-15α)，3.71(1H，m，H-2)，3.45(1H，d，J= 6.0 Hz，H-17)，3.34(1H，m，H-3)，2.62(1H，m，H-11α)，2.59(2H，m，H-7)，2.44(1H，m，H-8)，2.28(1H，t，J= 11.2 Hz，H-1α)，2.12(2H，m，H-4)，2.06(1H，m，H-12α)，1.55(1H，s，H-21)，1.36(1H，m，H-11β)，1.27(1H，m，H-9)，1.25(1H，m，H-12β)，1.08(1H，t，J= 11.2Hz，H-1β)，0.97(1H，m，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：175.4(C-14)，143.4(C-18)，138.8(C-5)，121.0(C-6)，118.2(C-20)，113.8(C-13)，76.1(C-16)，75.1(C-2)，72.2(C-3)，67.3(C-15)，55.7(C-17)，52.5(C-9)，44.1(C-1)，39.9(C-8)，39.9(C-10)，38.8(C-4)，29.7(C-12)，27.9(C-7)，24.6(C-21)，23.6(C-11)，19.1(C-19)。以上数据与文献[9]报道基本一致，故鉴定化合物1为glaucogenin A。

化合物2白色粉末；ESI-MS：m/z543[M +Na]+，确定分子质量520；分子式C28H40O9；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.29(1H，s，H-18)，5.44(1H，d，J= 6.0 Hz，H-6)，5.34(1H，m，H-16)，4.57(1H，dd，J= 1.8，12.0 Hz，H-1′)，4.17(1H，t，J= 6.0 Hz，H-15β)，3.86(1H，t，J= 6.0 Hz，H-15α)，3.73(1H，m，H-2)，3.45(1H，m，H-4′)，3.42(1H，s，H-6′-OCH3)，3.40(1H，m，H-17)，3.30(1H，m，H-3)，3.23(1H，m，H-5′)，3.20(1H，m，H-3′)，2.53(1H，m，H-11α)，2.48(1H，m，H-8)，2.40(1H，m，H-7α)，2.34(1H，m，H-4β)，2.34(1H，m，H-2′α)，2.29(1H，m，H-4α)，2.27(1H，m，H-12α)，2.06(1H，m，H-7β)，2.04(1H，m，H-1α)，1.55(1H，s，H-21)，1.53(1H，m，H-2′β)，1.38(1H，d，J= 6.0 Hz，H-6′)，1.28(1H，m，H-11β)，1.26(1H，m，H-12β)，1.24(1H，t，J= 6.0 Hz，H-9)，1.03(1H，m，H-1β)，0.97(1H，m，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：175.4(C-14)，143.5(C-18)，139.0(C-5)，120.8(C-6)，118.1(C-20)，113.7(C-13)，99.9(C-1′)，86.8(C-3)，80.5(C-4′)，75.2(C-16)，75.2(C-3′)，71.9(C-2)，69.7(C-5′)，67.5(C-15)，56.4(C-17)，55.7(C-7′)，52.6(C-9)，43.8(C-1)，39.9(C-8)，39.2(C-10)，37.4(C-4)，35.5(C-2′)，29.7(C-12)，28.0(C-7)，24.6(C-21)，23.6(C-11)，18.9(C-6′)，17.7(C-19)。以上数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定化合物2为glaucogenin A 3-O-β-D-cymaropyranoside。

化合物3白色粉末；ESI-MS：m/z467[M +Na]+，确定分子质量444；分子式C27H28N2O4；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.74(2H，d，J= 6.0 Hz，H-2′，H-6′)，7.56(1H，t，J= 7.2 Hz，H-4′)，7.47(2H，t，J= 7.6 Hz，H-3′，H-5′)，7.32～7.08(10H，m)，6.84(1H，d，J= 8.4 Hz，H-5)，6.12(1H，d，J= 9.6 Hz，H-5)，4.81(1H，m，H-7)，4.37(1H，m，H-4)，3.96(1H，dd，J= 12.0，4.8 Hz，H-3β)，3.84(1H，dd，J= 12.0，4.8 Hz，H-3α)，3.23(1H，dd，J= 12.0，6.0 Hz，H-10β)，3.08(1H，dd，J= 12.0，6.0 Hz，H-10α)，2.75(2H，m，H-11)，2.05(3H，s，1-H-OCH3)；13C NMR(600 MHz，CDCl3)δ：170.8(C-2)，170.3(C-6)，167.1(C-9)，136.7(C-1′′)，136.7(C-1′′′)，133.7(C-1′)，131.9(C-4′)，129.3(C-3′′)，129.3(C-5′′)，129.3(C-3′)，129.3(C-5′)，129.1(C-3′′′)，129.1(C-5′′′)，128.8(C-2′′)，128.8(C-6′′)，128.7(C-2′)，128.7(C-6′)，128.6(C-2′′′)，128.6(C-6′′′)，127.1(C-4′′)，126.8(C-4′′′)，64.6(C-3)，55.0(C-7)，49.4(C-4)，38.5(C-10)，37.4(C-10)，20.8(C-1)。以上数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定化合物3为N-(N-benzoyl-S-phenylalaninyl)-S-phenylalaninol acetate。

化合物4白色粉末；ESI-MS：m/z529[M +Na]+，确定分子质量506；分子式C32H30N2O4；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.73(1H，d，J= 9.0 Hz，H-2′)，7.73(1H，d，J= 9.0 Hz，H-6′)，7.69(1H，d，J= 9.0 Hz，H-2′′′′)，7.69(1H，d，J= 9.0 Hz，H-6′′′′)，7.54(1H，t，J= 6.0 Hz，H-4′′′′)，7.46～7.23(15H，m)，6.69(1H，d，J= 9.6 Hz，H-4)，6.56(1H，d，J= 7.2 Hz，H-7)，4.96(1H，q，J= 7.2 Hz，H-6)，4.64(1H，m，H-3)，4.08(1H，dd，J= 1.8，9.6 Hz，H-2)，3.34(1H，dd，J= 9.0，14.4 Hz，H-10)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：171.9(C-5)，167.4(C-8)，167.2(C-1)，137.2(C-1′′′)，135.8(C-1′′)，134.2(C-1′)，133.3(C-1′′′′)，132.0(C-4′′′′)，131.4(C-4′)，129.3(C-3′′)，129.3(C-5′′)，129.2(C-3′′′)，129.2(C-5′′′)，128.9(C-2′′)，128.9(C-6′′)，128.7(C-2′′′′)，128.7(C-6′′′′)，128.7(C-2′′′)，128.7(C-6′′′)，128.4(C-2′)，128.4(C-6′)，127.4(C-4′′)，127.1(C-3′)，127.1(C-5′)，127.1(C-3′′′′)，127.1(C-5′′′′)，126.8(C-4′′′)，65.4(C-2)，54.5(C-6)，50.3(C-3)，37.5(C-9)，37.3(C-10)。以上数据与文献[12]报道基本一致，故鉴定化合物4为N-(N-benzoyl-S-phenylalaninyl)-S-phenylalaninol benzoate。

化合物5白色粉末；ESI-MS：m/z307[M +Na]+，确定分子质量284；分子式C19H24O2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.20(1H，s，H-6)，6.20(1H，s，H-7)，5.71(1H，s，H-4)，2.48(1H，m，H-2β)，2.46(1H，m，H-16β)，2.38(1H，m，H-2α)，2.15(1H，m，H-12β)，2.12(1H，m，H-16α)，2.03(1H，m，H-1β)，2.02(1H，m，H-15α)，1.89(1H，m，H-8)，1.74(1H，m，H-12α)，1.72(1H，m，H-1α)，1.71(1H，m，H-15β)，1.70(1H，m，H-11α)，1.53(1H，m，H-14)，1.47(1H，m，H-11β)，1.33(1H，m，H-9)，1.16(1H，s，H-19)，0.98(1H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：219.5(C-17)，199.4(C-3)，162.9(C-5)，138.4(C-7)，128.8(C-6)，124.2(C-4)，50.8(C-14)，48.7(C-9)，48.3(C-13)，37.0(C-10)，36.1(C-8)，35.6(C-16)，33.9(C-1)，33.9(C-1)，31.3(C-12)，21.4(C-15)，20.0(C-11)，16.3(C-19)，13.7(C-18)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故鉴定化合物5为androst-4,6-dien-3,17-dione。

化合物6白色粉末；ESI-MS：m/z337[M +Na]+，确定分子质量314；分子式C21H30O2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.14(1H，dd，J= 9.8，2.6 Hz，H-6)，6.12(1H，d，J= 9.8 Hz，H-7)，5.69(1H，s，H-4)，3.77(1H，m，H-20)，2.45(1H，m，H-2β)，2.36(1H，m，H-2α)，2.25(1H，m，H-12β)，2.05(1H，m，H-1β)，2.03(1H，m，H-15α)，2.02(1H，m，H-16α)，1.76(1H，m，H-8)，1.74(1H，m，H-12α)，1.72(1H，m，H-11α)，1.70(1H，m，H-1α)，1.68(1H，m，H-15β)，1.67(1H，m，H-16β)，1.53(1H，m，H-14)，1.47(1H，m，H-11β)，1.32(1H，m，H-9)，1.27(1H，d，J= 6.0 Hz，H-20)，1.16(3H，s，H-19)，0.98(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：199.6(C-3)，163.8(C-5)，141.2(C-7)，128.0(C-6)，123.6(C-4)，70.0(C-20)，58.1(C-14)，53.9(C-17)，50.7(C-9)，42.7(C-13)，38.6(C-12)，37.3(C-8)，36.1(C-10)，34.0(C-1)，33.9(C-2)，25.5(C-16)，23.6(C-15)，23.6(C-21)，20.4(C-11)，16.3(C-19)，12.5(C-18)。以上数据与文献[14]报道基本一致，故鉴定化合物6为20-hydroxy-4,6-diene-gestrol-3-one。

化合物7黄色粉末；ESI-MS：m/z307[M +Na]+，确定分子质量284；分子式C16H12O5；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：13.03(1H，s，5-OH)，7.92(2H，m，H-2′，6′)，7.58(3H，m，H-3′，4′，5′)，6.68(1H，s，H-8)，6.63(1H，s，H-3)，4.09(3H，s，OCH3-6)；13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ：183.0(C-4)，164.1(C-2)，155.2(C-7)，153.3(C-5)，152.1(C-9)，131.9(C-4′)，130.4(C-1′)，130.4(C-6)，129.1(C-3′)，129.1(C-5′)，126.3(C-2′)，126.3(C-6′)，105.9(C-3)，105.3(C-10)，93.4(C-8)，60.9(OCH3-6)。以上数据与文献[15]报道基本一致，故鉴定化合物7为5,7-dihydroxy-6-methoxyflavone。

化合物8黄色粉末；ESI-MS：m/z307[M +Na]+，确定分子质量284；分子式C16H12O5；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：12.52(1H，s，OH-5)，7.92(1H，m，H-2′，6′)，7.59(1H，m，H-3′，4′，5′)，6.72(1H，s，H-3)，6.48(1H，s，H-6)，4.07(1H，s，OCH3-6)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：182.5(C-4)，163.5(C-2)，157.8(C-7)，155.3(C-5)，148.9(C-9)，132.0(C-4′)，131.3(C-1′)，129.3(C-3′)，129.3(C-5′)，126.9(C-8)，126.2(C-2′)，126.2(C-6′)，105.3(C-3)，105.3(C-10)，98.9(C-6)，62.1(OCH3-8)。以上数据与文献[16]报道基本一致，故鉴定化合物8为5,7-dihydroxy-8-methoxyflavone。

化合物9无色粉末；ESI-MS：m/z218[M +Na]+，确定分子质量195；分子式C11H17NO2；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：9.66(1H，s，H-2-CHO)，6.96(1H，d，J= 4.8 Hz，H-3)，6.26(1H，d，J= 4.8 Hz，H-4)，4.40(2H，m，H-1′)，3.67(3H，s，H-6)，1.61(2H，m，H-2′)，1.60(2H，m，H-3′)，1.36(3H，s，H-4′)，1.31(3H，s，H-5′)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：179.3(C-1)，135.2(C-2)，131.5(C-5)，125.0(C-3)，109.7(C-4)，51.7(C-6)，48.0(C-1′)，34.9(C-2′)，30.2(C-4′)，26.4(C-3′)，23.4(C-5′)。以上数据与文献[17]报道基本一致，故鉴定化合物31为5-(hydroxymethyl)-1-isopentyl-1H-pyrrole-2-carbaldehyde。

化合物10白色粉末；ESI-MS：m/z207[M +Na]+，确定分子质量184；分子式C10H16O3；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.91(1H，t，J= 6.0 Hz，H-3)，5.91(1H，q，J= 6.0 Hz)，5.27(1H，d，J= 18.0 Hz，H-8α)，5.12(1H，d，J= 12.0 Hz，H-8β)，2.26(2H，m，H-4)，1.83(3H，s，H-9)，1.67(2H，m，H-5)，1.33(3H，s，H-10)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：173.1(C-1)，144.7(C-7)，144.3(C-8)，127.2(C-2)，112.4(C-3)，73.2(C-6)，40.4(C-5)，27.9(C-10)，23.7(C-4)，12.0(C-9)。以上数据与文献[18]报道基本一致，故鉴定化合物10为mono-terpenes。

化合物11白色粉末；ESI-MS：m/z247[M +Na]+，确定分子质量224；分子式C11H12O5；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：12.12(1H，s，H-3′-COOH)，8.86(1H，s，3-OH)，7.51(1H，d，J= 18.0 Hz，H-1′)，6.99(2H，s，H-1)，6.99(2H，s，H-5)，6.43(1H，d，J= 18.0 Hz，H-2′)，3.82(3H，s，H-2-OCH3)，3.82(3H，s，H-4-OCH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：168.0(C-3′)，148.0(C-2)，148.0(C-4)，144.8(C-1′)，138.0(C-3)，124.6(C-6)，116.1(C-2′)，106.1(C-1)，106.1(C-5)，56.1(OCH3-2)，56.1(OCH3-4)。以上数据与文献[19]报道基本一致，故鉴定化合物11为4-hydroxy-3,5-dimethoxybenzoic acid。

化合物12白色粉末；ESI-MS：m/z265[M +Na]+，确定分子质量242；分子式C12H18O5；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：6.51(2H，s，H-2，6)，3.91(6H，s，H-3，5-OCH3)，3.80(1H，m，H-8)，3.75(1H，d，J= 8.4 Hz，H-7)，3.24(3H，s，7-H-OCH3)，0.97(d，J= 6.6 Hz，H-9)；13C-NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：147.1(C-3，5)，134.6(C-4)，129.5(C-1)，104.3(C-2)，104.3(C-6)，89.3(C-7)，71.5(C-8)，56.6(OCH3-7)，56.3(OCH3-3)，56.3(OCH3-5)，18.1(C-9)。以上波谱数据与文献[20]报道基本一致，故可鉴定化合物12为pavonisol。

化合物13白色粉末；ESI-MS：m/z221[M+Na]+，确定分子质量198；分子式C9H10O5；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：7.40(2H，s，H-2，6)，3.97(6H，s，H-3，5-OCH3)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：170.6(C=O)，146.7(C-3)，146.7(C-5)，140.0(C-1)，120.0(C-4)，107.4(C-2)，107.4(C-6)，56.5(OCH3-3)，56.5(OCH3-5)。以上数据与文献[21]报道基本一致，故鉴定化合物13为4-hydroxy-3,5-dimethoxy-benzoic acid。

3.2 抗烟草花叶病毒活性结果

采用2.2的三种半叶枯斑法和离体叶圆片法对分离得到的化合物1～10进行抗TMV活性测试，以宁南霉素作为阳性对照药物。测试结果见表1。从活性结果来看，化合物1～4和9均有钝化的抗TMV活性，但是化合物1～3均不具有保护活性，说明化合物1～3的抗TMV活性不是由植物系统获得抗性产生。化合物4具有保护活性，说明其抗TMV活性除了作用于TMV病毒外，还由植物系统获得抗性产生。以上化合物活性均与离体叶圆片法活性相同，并首次发现化合物3、4、9具有抗TMV活性。

表1 化合物1～10的抗TMV活性结果

注：宁南霉素为阳性对照药物，a50 μg/mL，b50 μg/mL，c200 μg/mL，d200 μg/mL。

Note:Ningnanmycin was used as positive control drug,a50 μg/mL,b50 μg/mL,c200μg/mL,d200 μg/mL.

4 结论

通过应用多种色谱方法从萝藦科植物徐长卿根茎的乙醇提取物中分离得到 13个单体化合物，化合物2～5和7～10为首次从该植物中分离得到。对化合物1～10进行抗TMV活性测试，从活性结果来看，化合物1～4和9均有钝化的抗TMV活性，且化合物4具有保护活性，说明化合物4抗TMV活性除了作用于TMV病毒外，还由植物系统获得抗性产生。除了seco-pregnane类C21甾体化合物外，首次发现化合物3、4、9具有抗TMV活性，丰富抗TMV化合物结构的多样性。本研究成果丰富了徐长卿根茎中的化学成分及生物活性内容，为其进一步的研究开发提供参考资料。