三种杀虫剂亚致死剂量对草地贪夜蛾细胞色素P450基因表达的影响

张百重, 苏 栩, 卢留洋, 甄丛爱, 朱 斌, 李亚设, 董文阳,汪 耿, 胥燕博, 孔凡彬, 刘润强, 陈锡岭,*, 高希武,*

(1. 河南科技学院资源与环境学院, 河南新乡 453003; 2. 中国农业大学昆虫学系, 北京 100193)

草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda是一种具有重大入侵性且危害严重的杂食性害虫，主要危害玉米、水稻、高粱、花生等作物(Goergenetal., 2016; 刘杰等, 2019)。目前，草地贪夜蛾的防治手段仍以化学防治为主(Okumaetal., 2018; Togolaetal., 2018; 赵胜园等, 2019)。Hardke等(2011)报道氯虫苯甲酰胺、氰虫酰胺、氟虫双酰胺、乙基多杀菌素、茚虫威、高效氯氟氰菊酯、甲氧虫酰肼、双苯氟脲等对该害虫防治效果较好。2019年我国推荐防治草地贪夜蛾的药剂有氯虫苯甲酰胺、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(甲维盐)、乙基多杀菌素、苏云金杆菌Bacillusthuringiensis(Bt)等25种。氯虫苯甲酰胺、甲维盐及Bt作为目前防治鳞翅目害虫的主要药剂(潘有祥, 2005; Cordovaetal., 2006)。但在实际生产中，由于这些杀虫剂的长期不合理使用，部分害虫已产生不同程度的抗性，如小菜蛾Plutellaxylostella田间种群对Bt抗性倍数高达200多倍、对氯虫苯甲酰胺抗性倍数高达2 000多倍(胡珍娣等, 2012; Wang and Wu, 2012; Wangetal., 2013; 夏耀民等, 2013)，粘虫田间种群对氯虫苯甲酰胺抗性倍数为1.314～4.213倍、对甲维盐抗性倍数为1.000～4.385倍(董杰等, 2014; Liuetal., 2016)，在巴西草地贪夜蛾田间种群已对Bt产生10倍以上的抗性(Monneratetal., 2015)。害虫对杀虫剂的抗性机制主要涉及靶标抗性和代谢抗性两方面。除靶标抗性外，解毒酶代谢活性增加将杀虫剂代谢成无毒或毒性较低产物是害虫产生抗药性的另一个重要方面(Francisetal., 2006; 邱星辉, 2014; 李秀霞等, 2015)。杀虫剂通过影响害虫体内解毒酶相关基因的表达增加其代谢活性，从而增加害虫对杀虫剂的抗性(或耐药性)(陈澄宇等, 2015; Elzakietal., 2015)。

细胞色素P450是昆虫体内的重要代谢酶系之一，能够代谢多种内源和外源化合物(Zhuetal., 2010; Riveronetal., 2013; Edietal., 2014)。害虫P450酶活性能够被农药等外源化合物诱导升高，进而使昆虫适应多样化的环境(Van Pottelbergeetal., 2008; Yangetal., 2015)。P450基因表达被杀虫剂诱导上升是害虫产生抗药性的普遍机制(邱星辉, 2014)。研究表明，杀虫剂亚致死剂量可诱导P450活性上升，以及多个P450基因表达上调(徐鹿, 2017; 张琪慧等, 2018; 刘俊杰等, 2019)，进而促进其产生耐药性。我们前期研究表明，用杀虫剂的LC10处理草地贪夜蛾2龄幼虫48 h时对P450基因表达的诱导效应最好。氯虫苯甲酰胺、甲维盐及Bt作为防治草地贪夜蛾的主要有效药剂，研究氯虫苯甲酰胺、甲维盐及Bt亚致死剂量对草地贪夜蛾P450基因表达的诱导效应在评估其在害虫防治中的作用有着重要的意义。

因此，本研究根据Giraudo等(2015)报道的植物次生物质和杀虫剂对草地贪夜蛾42个P450基因表达影响的基础上，从中选择了可能被杀虫剂诱导表达的16个P450基因，而后采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)技术分析不同杀虫剂亚致死剂量对草地贪夜蛾16个P450基因表达的影响，以期为合理科学使用农药及深入开展研究草地贪夜蛾P450基因的功能和调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

供试草地贪夜蛾来自云南农业大学植物保护学院昆虫病原体实验室馈赠，在温度23～25℃、相对湿度50%～70%、光周期17L∶7D的条件下饲养于养虫笼中，采用玉米叶片和人工饲料饲养。

1.2 试剂与药品

RNA提取试剂(TRIzol Reagent)，美国Invitrogen公司产品；cDNA反转录试剂盒(FastKing RT Kit)和Pfu Taq DNA合成酶，天根生化科技(北京)有限公司产品；qPCR 荧光染料TB GreenTMPremix ExTaqTMII、连接载体pMD19-T、大肠杆菌EscherichiacoliDH5α感受态细胞，日本TaKaRa公司产品；DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒(EZNA Plasmid Mini Kit)，美国Omega公司产品；98%氯虫苯甲酰胺(chlorantraniliprole)原药，94%甲维盐(emamectin benzoate)原药，来自深圳诺普信股份有限公司；32 000 IU/mg苏云金杆菌(Bt)，来自山东鲁抗生物农药有限责任公司；其余所用的化学试剂均为国产分析纯试剂。

Bio-Rad T100TMPCR仪、PowerPacTM电泳仪、CFX96实时荧光定量PCR仪，美国Bio-Rad公司产品；凝胶成像系统BG-gdsAUTO，北京百晶生物技术有限公司产品；Nano Photometer TMP-Class微量核酸蛋白分析仪，德国Implen公司产品；引物由华大基因合成。

1.3 毒力测定

为确定处理草地贪夜蛾的杀虫剂亚致死剂量，采用叶片浸渍法(游灵等, 2013; 董杰等, 2014)分别测定氯虫苯甲酰胺、甲维盐和苏云金杆菌(Bt)对草地贪夜蛾的毒力。先将氯虫苯甲酰胺和甲维盐原药分别用丙酮配制成母液，Bt母液用含0.05%Triton X-100的蒸馏水配制，使用时再用蒸馏水含0.05% Triton X-100按等比稀释5个浓度，每个浓度3次重复。用移液枪分别吸取2 mL稀释后的药液加入到4 mL离心管中，另吸取2 mL蒸馏水包含0.05% Triton X-100加入到离心管中作为对照。将培养的3叶期玉米叶片剪成长×宽=5 cm×0.5 cm的长方形叶片在不同处理中浸渍15 s，取出晾干后放入直径为9 cm的玻璃培养皿中，每个培养皿放入大小一致、健康的草地贪夜蛾2龄幼虫15头，置于温度23～25℃、相对湿度70%～80%、光周期14L∶10D条件下的养虫室饲养，每个处理重复3次。48 h后观察和统计各处理草地贪夜蛾的死亡情况，用镊子拨动仍不活动可判断死亡。

1.4 RT-qPCR测定3种杀虫剂处理后草地贪夜蛾P450基因的表达量

1.4.1草地贪夜蛾样品药剂处理：用蒸馏水包含0.05% (v/v) Triton X-100分别将氯虫苯甲酰胺、甲维盐和Bt稀释成其相应的LC10浓度，将新鲜玉米叶片在药液中浸渍15 s后取出，以在蒸馏水包含0.05% (v/v) Triton X-100中浸渍15 s的玉米叶片为对照，晾干后将其放入培养皿中，每个培养皿放入15头健康的草地贪夜蛾2龄幼虫。48 h后用离心管收集存活个体，立即浸入液氮，-80℃冷藏，备用。每个离心管收集3～5头试虫为一重复，每个处理设3个重复。

1.4.2总RNA的提取：总RNA的提取用Trizol试剂提取，用0.1% DEPC处理的无菌水清洗3次，加入l mL Trizol，按照Trizol、氯仿、异丙醇三步法提取，将所得总RNA溶解于经DEPC处理的水中。经检测，RNA完整性(RIN)数值位于6.7～7.6之间，0D260/OD280值在1.85～1.99之间，这些结果表明RNA的完整性和纯度都是较高的，达到了反转录的要求。

1.4.3cDNA第1链的合成：根据TaKaRa公司的Recombinant DNase Ⅰ(RNases-Free)使用说明书，在反转录前进行草地贪夜蛾总RNA的基因组DNA的消化反应，cDNA 第1链的合成按TaKaRa公司反转录试剂盒(PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit)说明进行，合成qPCR cDNA模板。

1.4.4基因表达量测定：按照Real Master Mix SYBR Green PCR Kit操作说明书对16个P450基因进行qPCR验证，以GADPH为内参基因(de Souza, 2013; do Nascimentoetal., 2015)，16个P450基因的引物见表1，引物委托深圳华大基因股份有限公司合成。qPCR反应体系(20 μL): cDNA 1.0 μL, SYBR Premix Ex TaqTM10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, 50×Rox Reference Dye II 0.4 μL, ddH2O 7.8 μL。 qPCR 反应条件: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 55℃ 30 s, 循环40次。采用7500实时荧光定量PCR系统对数据进行分析，采用2-ΔΔCt法计算草地贪夜蛾细胞色素P450基因的相对表达量(Pfaffl, 2001)。

表1 草地贪夜蛾P450基因和内参基因qPCR引物Table 1 Primer pairs used for qPCR analysis of cytochrome P450 genes anda candidate housekeeping gene in Spodoptera frugiperda

1.5 数据分析

应用Excel 2010软件和SPSS 19.0(SPSS Inc., Chicago, IL)对数据进行整理和统计分析，其中各处理的校正死亡率采用SPSS 19.0进行统计分析后通过probit analysis计算各杀虫剂对草地贪夜蛾的亚致死剂量，采用Student氏t检验法对P450基因表达数据进行差异显著性检验。

2 结果

2.1 3种杀虫剂对草地贪夜蛾2龄幼虫的毒力

氯虫苯甲酰胺、甲维盐和Bt对草地贪夜蛾2龄幼虫的致死中浓度(LC50)分别为2.087, 0.602和2 185.365 mg/L，对草地贪夜蛾2龄幼虫的LC10分别为0.931, 0.283和1 089.688 mg/L(表2)。

表2 氯虫苯甲酰胺、甲维盐和苏云金杆菌(Bt)对草地贪夜蛾2龄幼虫的毒力Table 2 Toxicity of chlorantraniliprole, emamectin benzoate and Bacillus thuringiensisagainst the 2nd instar larvae of Spodoptera frugiperda

幼虫平均体重为9.58 mg/头；采用叶片浸渍法处理幼虫，处理后48 h时测定毒力。Average larval weight was 9.58 mg per larva. The larvae were treated by leaf-dipping method, and the toxicity was determined at 48 h post treatment.

2.2 杀虫剂对草地贪夜蛾2龄幼虫P450基因表达影响

首先根据设计引物进行PCR扩增，并通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，以确定PCR扩增条带与目的条带大小一致，且只出现一条带，表明无引物二聚体情况出现，无非特异性扩增，符合荧光定量PCR的条件。选择草地贪夜蛾2龄幼虫样品提取总RNA，以反转录所得的cDNA为模板按一定比例进行梯度稀释，内参基因GAPDH和16个P450基因分别按不同浓度模板进行qPCR。结果表明，草地贪夜蛾内参基因GAPDH以及16个P450 基因的扩增效率具有一致性(表1)。

用LC10氯虫苯甲酰胺处理草地贪夜蛾2龄幼虫48 h后，16个P450基因，即CYP4G75,CYP6AB12,CYP6AN4,CYP6B50,CYP321A7,CY321A8,CYP321A9,CYP321A10,CYP321B1,CYP337B5,CYP9A60,CYP9A59,CYP9A58,CYP6AE44,CYP6AE43及CYP340L1的表达水平分别为对照的3.58, 2.78, 0.83, 4.93, 8.85, 5.71, 15.30, 5.48, 8.55, 5.43, 0.60, 5.16, 3.65, 34.60, 3.52及0.43倍(图1)；除了CYP6AN4表达不受氯虫苯甲酰胺影响以及CYP9A60和CYP340L1表达下调外，其余13个P450基因表达均显著上调，其中CYP6AE44能被氯虫苯甲酰胺诱导最大值，为对照的34.60倍。

图1 亚致死剂量(LC10)氯虫苯甲酰胺对草地贪夜蛾2龄幼虫P450基因表达的影响Fig. 1 Effect of chlorantraniliprole at the sublethal dose (LC10) on the expression of P450 genesin the 2nd instar larvae of Spodoptera frugiperda用LC10浓度(见表2)农药采用浸渍法处理2龄幼虫, 48 h后检测基因表达量。图中数据为平均数±标准差；星号表示处理与对照(0.05% Triton X-100)间经Student氏t检验在0.05水平差异显著。The 2nd instar larvae were treated with pesticides at the LC10 concentration (as shown in Table 2) by leaf-dipping method, and the gene expression level was determined at 48 h post treatment. Data are mean±SD. The asterisk indicates significant difference between the treatment and the control (0.05% Triton X-100) at the 0.05 level by Student’s t-test. 图2和3同The same for Figs. 2 and 3.

用LC10甲维盐处理草地贪夜蛾2龄幼虫48 h后，16个P450基因，即CYP4G75,CYP6AB12,CYP6AN4,CYP6B50,CYP321A7,CY321A8,CYP321A9,CYP321A10,CYP321B1,CYP337B5,CYP9A60,CYP9A59,CYP9A58,CYP6AE44,CYP6AE43及CYP340L1的表达水平分别为对照的6.15, 2.13, 0.97, 1.28, 3.76, 8.58, 24.00, 3.41, 28.70, 5.41, 0.64, 0.80, 1.85, 8.71, 1.62及0.76倍(图2)；除了CYP6AN4,CYP6B50,CYP9A60,CYP9A59及CYP340L1表达不受甲维盐影响外，其余11个P450基因表达均显著上调，其中CYP321B1能被甲维盐诱导出最大值，为对照的28.70倍。

用LC10Bt处理草地贪夜蛾2龄幼虫48 h后，16个P450基因，即CYP4G75,CYP6AB12,CYP6AN4,CYP6B50,CYP321A7,CY321A8,CYP321A9,CYP321A10,CYP321B1,CYP337B5,CYP9A60,CYP9A59,CYP9A58,CYP6AE44,CYP6AE43及CYP340L1表达水平分别为对照的4.37, 2.87, 2.52, 0.31, 3.55, 15.30, 18.50, 5.53, 36.20, 19.60, 0.69, 1.18, 0.62, 40.80, 5.58及0.94倍(图3)；除了CYP9A60,CYP9A59及CYP340L1表达不受Bt 影响以及CYP6B50和CYP9A58表达下调外， 其余11个P450基因表达均显著上调，其中CYP6AE44能被Bt诱导最大值，为对照的40.80倍。

图2 亚致死剂量(LC10)甲维盐对草地贪夜蛾2龄幼虫P450基因表达的影响Fig. 2 Effect of emamectin benzoate at the sublethal dose (LC10) on the expressionof P450 genes in the 2nd instar larvae of Spodoptera frugiperda

图3 亚致死剂量(LC10)苏云金杆菌(Bt)对草地贪夜蛾2龄幼虫P450基因表达的影响Fig. 3 Effect of Bacillus thuringiensis (Bt) at the sublethal dose (LC10) on the expressionof P450 genes in the 2nd instar larvae of Spodoptera frugiperda

3 讨论

氯虫苯甲酰胺、甲维盐和Bt是广泛用于草地贪夜蛾防治的主要有效药剂(陈利民等, 2019; 王勇庆等, 2019)，但随着这些药剂的大量使用，部分地区草地贪夜蛾已对其产生一定的抗性(Burtetetal., 2017; Gutiérrez-Morenoetal., 2018)。研究表明，细胞色素P450在草地贪夜蛾抗药性中发挥着重要作用，P450诱导表达谱测定发现CYP6B, CYP321A和CYP9A等亚家族的多个基因被杀虫剂诱导表达，推测一些基因可能参与草地贪夜蛾对有毒物质的代谢(Giraudoetal., 2015)。亚致死剂量下的杀虫剂对害虫产生一定的刺激效应，有助于害虫抗药性的发生。因此，为了进一步明确草地贪夜蛾P450基因能否被推荐的某些杀虫剂诱导，我们测定了亚致死剂量下的杀虫剂对草地贪夜蛾P450基因表达的影响，结果发现草地贪夜蛾响应氯虫苯甲酰胺、甲维盐和Bt胁迫上调的P450基因分别为CYP3家族和CYP4家族基因(Feyereisen, 2006)，这些家族基因被认为与害虫抗药性最相关(Lietal., 2018)。王学贵等(2015)研究结果显示，当用氯虫苯甲酰胺处理甜菜夜蛾Spodopteraexigua后，P450基因的过量表达可能参与甜菜夜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性。戴瀚洋等(2015)发现亚致死剂量甲维盐诱导甜菜夜蛾S.exigua时，甜菜夜蛾的P450基因及其他解毒酶基因响应杀虫剂胁迫上调表达。我们的测定结果亦是如此，13个P450基因，即CYP4G75,CYP6AB12,CYP6B50,CYP321A7,CY321A8,CYP321A9,CYP321A10,CYP321B1,CYP337B5,CYP9A59,CYP9A58,CYP6AE44及CYP6AE43均能被氯虫苯甲酰胺显著诱导，而CYP6AN4,CYP9A60及CYP340L1不能被诱导；11个P450基因，即CYP4G75,CYP6AB12,CYP321A7,CY321A8,CYP321A9,CYP321A10,CYP321B1,CYP337B5,CYP9A58,CYP6AE44及CYP6AE43能被甲维盐显著诱导，而CYP6AN4,CYP6B50,CYP9A60,CYP9A59及CYP340L1表达不受甲维盐影响；11个P450基因，即CYP4G75,CYP6AB12,CYP6AN4,CYP321A7,CY321A8,CYP321A9,CYP321A10,CYP321B1,CYP337B5,CYP6AE44及CYP6AE43能被Bt显著诱导，而CYP9A60,CYP9A59,CYP340L1,CYP6B50及CYP9A58不能被Bt诱导。其中10个P450基因，即CYP4G75,CYP6AB12,CYP321A7,CY321A8,CYP321A9,CYP321A10,CYP321B1,CYP337B5,CYP6AE44及CYP6AE43能够被3种杀虫剂同时诱导，推测其可能是广谱性的P450基因，具有响应杀虫剂的多重选择压力的功能。而CYP6B50和CYP9A59只能被氯虫苯甲酰胺诱导；CYP6AN4只能被Bt诱导；推测其可能是专一性的P450基因。不同P450基因成员的底物不同，但它们之间可能存在重叠以适应环境的变化，多个P450基因表达响应杀虫剂等外源化合物诱导的同时均有可能用于响应杀虫剂的选择压力，表现出进化的可塑性(邱星辉, 2014)。此外，P450基因表达的可诱导性是代谢抗性产生的重要方式(陈秋霞, 2001; 张百重等, 2018; 朱英慧, 2018)。而Giraudo等(2015)研究表明，草地贪夜蛾CYP6B, CYP321A和CYP9A亚家族基因能被植物化学品诱导，只有少量P450基因能被杀虫剂诱导，这部分P450基因大多属于CYP9A家族基因, 药剂种类、处理剂量、P450的专一性和普遍性、基因表达检测方法可能是造成结果不一致的重要因素，但具体原因需进一步研究。

氯虫苯甲酰胺、甲维盐和Bt作为目前防治玉米田鳞翅目害虫的主要有效药剂。因此，本研究阐述了亚致死剂量氯虫苯甲酰胺、甲维盐和Bt对草地贪夜蛾P450基因表达的影响，揭示草地贪夜蛾P450基因表达在杀虫剂胁迫下的可诱导性，为P450解毒酶参与害虫抗药性形成的机制提供基础资料。但受3种杀虫剂诱导上调表达的P450基因能否对杀虫剂代谢解毒，还需结合单一的P450蛋白异源表达和体外代谢及RNAi等方法进一步验证其功能。