乙基多杀菌素对草地贪夜蛾幼虫的毒力及对其解毒酶和乙酰胆碱酯酶活性的影响

高祖鹏, 郭井菲, 何康来, 王振营,*

(1. 吉林农业大学生物防治研究所, 天敌昆虫应用技术工程研究中心, 长春 130118; 2. 中国农业科学院植物保护研究所, 植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100193)

草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda, 鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，又称秋黏虫，是原产于美洲热带和亚热带地区的一种多食性、迁飞性重大农业害虫(Todd, 1980)。草地贪夜蛾具有繁殖能力强、迁飞距离远、寄主植物范围广和取食能力强等特点，若防控不及时，会对农业生产造成严重危害(郭井菲等, 2018)。草地贪夜蛾于2016年入侵非洲，2018年入侵到印度、缅甸，并于2019年1月入侵我国云南(Jingetal., 2019)，到9月已蔓延至全国26个省份，对我国玉米等农作物的产量构成了威胁(姜玉英等, 2019)。由于化学防控具有见效快、成本低的特点，因此化学农药是防治草地贪夜蛾重要手段之一。

乙基多杀菌素是美国陶氏益农公司研发的新一代杀虫剂，其具有杀虫谱广、杀虫效果好、用量低、对动物和环境较友好等特点，可用于多种鳞翅目害虫的防控(邱水林等, 2011)。在非洲地区，乙基多杀菌素作为防治草地贪夜蛾的主要农药之一被大面积推广使用(崔丽等, 2019)。在我国，乙基多杀菌素也对草地贪夜蛾表现出良好的防治效果。在室内用25 mg/mL乙基多杀菌素浸泡玉米叶片24 h和48 h后饲喂的草地贪夜蛾3龄幼虫的死亡率分别达到78%和97%(郑群等, 2019)。田间试验施用乙基多杀菌素3 d后，草地贪夜蛾的虫口减退率可达90%，5 d后达93%，防效明显(赵胜园等, 2019)。

任何农药长时间大量使用，都可能导致害虫产生抗药性。在波多黎各圣伊莎贝尔地区，2012年使用乙基多杀菌素可有效地防治草地贪夜蛾(Belayetal., 2012)，但到2018年，该地区田间草地贪夜蛾已对乙基多杀菌素产生14倍抗性(Gutiérrez-Morenoetal., 2019)。在昆虫体内，谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase, GST)、羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)和多功能氧化酶(mixed-functional oxidase, MFO)等解毒酶在应对化学农药及其他有毒物质过程中发挥着重要的作用，研究认为生物体内存在一套完整的解毒代谢系统，是不同作用靶标的杀虫剂之间存在交互作用的主要原因之一(Rodríguezetal., 2002; Kimetal., 2004; Lumjuanetal., 2005)。不同地区的施药程度与害虫对杀虫剂的抗性密切相关，化学农药的使用不当将导致害虫抗药性的产生(王芹芹等, 2019)。因此，了解草地贪夜蛾抗性机制对合理有效防治草地贪夜蛾具有重要意义。

本研究首次测定乙基多杀菌素对草地贪夜蛾不同龄期的室内毒力，确定乙基多杀菌素对草地贪夜蛾幼虫有效剂量；在此基础上，选择不同浓度(0.127, 0.183, 0.250, 0.400和0.572 mg/L)乙基多杀菌素处理的草地贪夜蛾幼虫，检测解毒酶(CarE, GST和MFO)和乙酰胆碱酯酶(acetyl cholinesterase, AchE)活性的变化，揭示解毒酶和乙酰胆碱酯酶在草地贪夜蛾体内的变化趋势，为明确乙基多杀菌素对草地贪夜蛾的作用机制、乙基多杀菌素的合理应用及草地贪夜蛾抗药性研究等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

草地贪夜蛾初始种群于2019年1月采集于云南省德宏州芒市(24.42°N, 98.60°E)冬玉米田，在中国农业科学院植物保护研究所玉米害虫组，于人工气候箱(上海一恒科学仪器有限公司，MGC-450HP-2)内(温度26±1℃，相对湿度65%±5%，光周期14L∶10D)，利用夜蛾科通用人工饲料饲养，饲养期间不接触任何农药试剂。取饲养至F3代的幼虫用于实验。

1.2 供试药剂

乙基多杀菌素原药、氯虫苯甲酰胺原药均由科迪华农业科技(上海)有限公司提供；二甲基亚砜(DMSO)购于北京睿恒均安科技有限公司；乙酰胆碱酯酶(AchE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、羧酸酯酶(CarE)和多功能氧化酶(MFO)活性试剂盒均采购于北京华佰泰生物科技有限公司。

1.3 室内毒力测定

首先将乙基多杀菌素和氯虫苯甲酰胺原药用DMSO试剂溶解，后用含0.1% Tween-80蒸馏水分别稀释成5～6个浓度梯度。

采用表面涂抹法进行生物测定。使用移液器将未凝固的人工饲料加至24孔细胞培养板中，置于室温下自然凝固。用移液器将系列梯度浓度的试剂加入饲料表面，每孔加入药剂体积为50 μL，待饲料表面干燥后，用毛笔选取长势一致且活跃的3龄初幼虫，并覆盖一层透气塑料膜，防止幼虫逃脱。分别在48 h后检测结果。每个浓度处理24头幼虫，重复3次，设置涂抹为含0.1%的Tween-80蒸馏水为对照。以毛笔轻触幼虫身体，无反应者视为死亡。

实验结果使用Excel 2010和PoloPlus计算各杀虫剂对草地贪夜蛾不同龄期幼虫的毒力回归曲线和致死中浓度。

1.4 乙基多杀菌素处理后草地贪夜蛾MFO, GST, CarE和AchE活性的测定

1.4.1药液配制：用0.1% Tween-80水溶液将乙基多杀菌素原药分别按照LC5, LC15, LC30, LC60和LC80的处理浓度(由1.3节测定结果经PoloPlus计算得出，即0.127, 0.183, 0.250, 0.400和0.572 mg/L)配制获得不同浓度的处理药液，以0.1% Tween-80水溶液为对照。

1.4.2酶源制备：根据张丽丽(2014)的方法配制酶源，并加以改进。分别取用上述不同浓度的乙基多杀菌素处理和对照液饲喂3龄幼虫，在48 h后每个处理随机挑选5头活虫置于研钵中，倒入适量的液氮将幼虫粉碎，并加入预冷的生理盐水；然后摇匀转入离心管，12 000 g 4℃离心15 min，取上清液作为酶源备用。

1.4.3酶活性测定：使用全波长扫描多功能读数仪(Multi-Mode Microplate Reader, FlexStation 3, Molecular Devices, 美国)测定酶活性。

各酶活性测定方法参考试剂盒说明书。采用酶联免疫吸附法(ELISA)，操作方法如下：准备试剂，样品和标准品(由试剂盒所提供)；加入准备好的标准品和样品，37℃反应30 min；洗涤5次，加入酶标试剂，37℃反应30 min；洗涤5 次，加入显色液，37℃反应10 min；加入终止液，15 min内读取OD值。

标准曲线及酶活性测定：标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.4.4蛋白含量测定: 利用考马斯亮蓝方法测定蛋白浓度(Bradford, 1976)。

1.5 数据分析

实验数据用Excel 2013, PoloPlus和SPASS 22.0处理，采用Tukey氏检验进行差异显著性检验，显著水平设定为P=0.05。

2 结果

2.1 乙基多杀菌素和氯虫苯甲酰胺对草地贪夜蛾幼虫的毒力

乙基多杀菌素和氯虫苯甲酰胺对草地贪夜蛾2, 3和4龄幼虫的室内毒力测定见表1。由表1可得，乙基多杀菌素与氯虫苯甲酰胺均对2和3龄幼虫均具有较好的杀虫活性，乙基多杀菌素对2和3龄幼虫的致死中浓度(LC50)分别为0.21和0.34 mg/L；氯虫苯甲酰胺对2和3龄幼虫的LC50分别为2.66和4.52 mg/L，分别为乙基多杀菌素的12.67和13.29倍。随着处理龄期增至4龄时，氯虫苯甲酰胺的杀虫活性有所降低，LC50为61.49 mg/L；而在同一龄期下，乙基多杀菌素的LC50小于氯虫苯甲酰胺，为0.59 mg/L，说明乙基多杀菌素对草地贪夜蛾幼虫具有良好的杀虫活性。

表1 乙基多杀菌素和氯虫苯甲酰胺对草地贪夜蛾不同龄期幼虫的毒力Table 1 Toxicities of spinetoram and chlorantraniliprole against the 2nd, 3rd and 4th instar larvaeof Spodopetera frugiperda

FL: 置信区间Confidence limit.

2.2 乙基多杀菌素对草地贪夜蛾幼虫体内解毒酶活性的影响

2.2.1MFO: 经过不同浓度乙基多杀菌素处理后，草地贪夜蛾3龄幼虫体内MFO活性变化表现为先升高、降低、再升高的趋势(图1: A)。草地贪夜蛾幼虫取食0.127 mg/L乙基多杀菌素后，MFO活性显著性上升；随着浓度增加至0.183和0.250 mg/L时，活性下降，但均显著高于对照水平(P<0.05);随着处理浓度继续增加，MFO活性再次升高，于处理浓度为0.572 mg/L时，达到最高值，为对照组的1.43倍。

2.2.2CarE：草地贪夜蛾幼虫取食0.127, 0.183和0.250 mg/L浓度的乙基多杀菌素后，CarE活性与对照相比无显著性差异(P>0.05)；随着浓度的逐渐增加，CarE活性也逐渐增加,当处理浓度达到0.572 mg/L时，CarE活性达到最高值，为20.52 U/mg pro(图1: B)。

图1 不同浓度乙基多杀菌素对草地贪夜蛾3龄幼虫体内解毒酶活性的影响Fig. 1 Effect of spinetoram at different concentrations on the activities of detoxifying enzymesin the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperdaA: MFO; B: CarE; C: GST. CK: 0.1% Tween-80. 幼虫分别经过不同浓度乙基多杀菌素处理48 h后测定酶活性；柱上标有不同字母表示显著差异(Tukey氏检验, P<0.05)。After the larvae were treated with different concentrations of spinetoram for 48 h, the enzyme activity was measured. Histograms with different letters indicate significant difference (Tukey’s test, P<0.05). 图2同The same for Fig. 2.

2.2.3GST：用5种浓度乙基多杀菌素处理草地贪夜蛾48 h后，幼虫体内GST活性逐渐增加；当处理浓度为0.183 mg/L时，GST活性下降，且与对照组活性无显著性差异(P>0.05)；随着处理浓度的继续增加，GST活性显著升高(P<0.05),但处理浓度为0.400和0.572 mg/L时，GST活性之间无显著性差异(P>0.05)(图1: C)。

2.3 乙基多杀菌素对草地贪夜蛾幼虫体内AchE活性的影响

幼虫体内AchE活性的变化为先上升、降低、再上升的趋势(图2)，与MFO的变化趋势相同。当浓度为0.572 mg/L时，AchE活性最高，为对照组的1.36倍；其次为浓度为0.183和0.400 mg/L时，AchE活性分别为21.76和21.40 U/mg pro;各浓度处理组AchE活性均显著高于对照(P<0.05)。

图2 不同浓度乙基多杀菌素对草地贪夜蛾3龄幼虫体内AchE活性的影响Fig. 2 Effect of spinetoram at different concentrationson the AchE activity in the 3rd instar larvae ofSpodoptera frugiperda

3 结论与讨论

乙基多杀菌素是一种具有低毒、高效特点的新型杀虫剂，其有效成分是从土壤中放线菌刺糖多孢菌Saccharopolysporaspinosa发酵产生的天然产物；其降解主要通过微生物完成的，因此乙基多杀菌素具有较高的安全性。室内及田间试验表明，乙基多杀菌素对草地贪夜蛾幼虫具有良好的防治效果(赵胜园等， 2019; 郑群等， 2019)。本研究发现，乙基多杀菌素对2, 3和4龄幼虫的LC50值分别为0.21, 0.34和0.59 mg/L， LC90值分别为0.59, 0.75和2.01 mg/L(表1)。与氯虫苯甲酰胺相比，乙基多杀菌素对不同龄期草地贪夜蛾幼虫具有更好的杀虫活性，具有更好的应用前景。

乙基多杀菌素通过刺激神经系统中的乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor, AChR)，延长了其反应速度，导致了其不能产生动作电位，从而使靶标害虫产生异常的兴奋和非功能性肌肉收缩，最终导致昆虫的中毒死亡(Salgado, 1998)。多杀菌素类杀虫剂的作用靶标为烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)，其在突触间的神经递质传递的过程中起着重要作用。昆虫体内的AchE能够在胆碱神经突触处通过快速水解兴奋性神经递质乙酰胆碱而终止神经冲动的传递，其敏感性的变化是昆虫产生抗药性的原因之一(孟琳琳等, 2010)。研究发现乙基多杀菌素对小菜蛾Plutellaxylostella体内乙酰胆碱酯酶活性的影响随着抗性的变化而变化(尹飞等, 2016)。本研究发现，随着乙基多杀菌素浓度增加，草地贪夜蛾3龄幼虫体内的AchE活性逐渐增加，并且在处理浓度为0.572 mg/L时活性最高(图2)。经乙基多杀菌素处理后，草地贪夜蛾幼虫体内AchE活性逐渐增加，推断其在毒杀过程中起着一定的作用，其具体作用方式需进一步探讨。MFO作为细胞色素P450最主要的组成部分之一，其具有最古老、最庞大的基因(Nelsonetal., 1993)。MFO可通过过氧烷基、羟基化环氧化和硫醚氢化等方式参与有机磷、有机氯和拟除虫菊酯类等农药的代谢。谢丙堂等(2015)通过对经乙基多杀菌素处理的棉铃虫Helicoverpaarmigera解毒酶活性研究发现，随着乙基多杀菌素浓度的增加，棉铃虫幼虫体内MFO活性逐渐增加。Sial等(2011)用乙基多杀菌素对蔷薇斜条卷叶蛾Choristoneurarosaceana连续进行多代汰选，获得了低水平抗性品系，通过对低水平抗性的研究发现，低水平抗性品系MFO活性有所升高，因此他们推测MFO可能参与乙基多杀菌素的代谢。我们的研究发现，草地贪夜蛾经过乙基多杀菌素处理后，其幼虫体内MFO的活性也逐渐增加(图1: A)，因此推断MFO是草地贪夜蛾对乙基多杀菌素产生抗性的潜在因素。

CarE作为一个水解酶，能够与进入昆虫体内的毒剂相结合，同时其与毒物集合后，活性有所降低，但是其对毒物的固定作用也是解毒机理的一部分。昆虫GST可增加虫体对有毒物质的可溶性并将其排出体外，从而达到解毒代谢的作用；同时在受到外界有毒物质刺激时，其体内的GST活力也会发生变化。通过研究乙基多杀菌素对地熊蜂Bombusterrestris的毒性研究发现，CarE作为初级代谢酶帮助地熊蜂代谢乙基多杀菌素；随着处理时间的加长，GST作为次级代谢酶帮助其代谢乙基多杀菌素(王欢和徐希莲, 2019)。本研究发现，GST活性在低浓度乙基多杀菌素(0.127 mg/L)处理下就显著增加；除0.183 mg/L以外，其余浓度处理下GST活性均与对照有显著差异；在0.400和0.572 mg/L浓度下，GST活性无显著性差异；而CarE活性只有在0.400 mg/L乙基多杀菌素处理时较对照显著增加，且在处理浓度为0.572 mg/L时活性达到最高(图1)。低浓度的杀虫剂对昆虫体内酶活性的作用目前还没有统一定论，其原因可能是作用方式和作用机理不同的杀虫剂对特定解毒酶的影响不同，还可能与杀虫剂摄入量、害虫个体耐药性、群体抗药性强弱等有直接关系(全林发等, 2016)。

草地贪夜蛾作为入侵并对我国粮食安全的造成严重威胁的重要害虫，化学防治是控制其为害的有效手段，但随着化学农药的大量使用，草地贪夜蛾对化学农药的抗药性将会逐渐显现。而研究草地贪夜蛾解毒酶活性的变化，是研究草地贪夜蛾产生抗药性的方法之一。本研究检测了乙基多杀菌素对草地贪夜蛾不同龄期幼虫的毒力及解毒酶活性和乙酰胆碱酯酶活性的影响，为草地贪夜蛾的有效防治及抗药性的研究提供了基础，但有关乙基多杀菌素对草地贪夜蛾抗性基因的发展有待进一步研究。