髁突软骨诱导外源性骨髓间充质干细胞成软骨分化的实验研究

张赵一淳 鹿蕾 于世宾 杨鸿旭 叶涛 冯剑颖

颞下颌关节(temporomandibular joint，TMJ)骨关节炎(osteoarthritis，OA)的典型病变为软骨退变和软骨下骨异常改建[1]。OA的干细胞治疗是目前的研究热点。临床研究显示给OA患者关节腔注射间充质干细胞可改善其临床症状[2-3]。动物实验显示关节腔注射间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)可明显抑制关节退变，且关节内注射的MSCs可在关节中定植，并表达软骨标记物-II型胶原[2]。课题组前期的研究也表明，颞下颌关节局部注射的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)可定向迁移和定植于病变髁突，并向软骨细胞分化[3]。但目前，病变髁突与正常髁突诱导BMSCs成软骨能力的差别及其机制还未见报道。c-myc和ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)在干细胞的成软骨分化中起着重要作用[4-7]，在髁突诱导BMSCs成软骨分化的效果有待研究。

本实验旨在研究正常和OA髁突软骨诱导外源性BMSCs成软骨分化能力的差别，及髁突软骨对BMSCs的c-myc和ERK1/2表达的影响。

1 材料与方法

1.1 软骨组织和BMSCs

8 周龄C57BL/6雌性小鼠(购自第四军医大学实验动物中心)随机分为实验组和操作对照组(各13 只)。分组情况见表 1。实验组建立单侧前牙反(unilateral anterior crossbite， UAC)诱导的小鼠TMJ OA模型[8]， 12 周后， 一部分(每组3 只)取双侧TMJ局部组织，用于组织学染色，另一部分(10 只)取双侧TMJ髁突软骨组织块，用于Transwell共培养。对照组操作流程同UAC组，只是最终不粘接不良修复体(表 1)。BMSCs为细胞系：C57BL/6的BMSCs(MUBMX-01001，Cyagen公司，美国)。

表 1 实验动物分组

1.2 组织学染色

HE染色：采用常规HE染色流程，封片后显微镜下观察。测量软骨厚度[8]。

甲苯胺蓝染色：细胞爬片在甲苯胺蓝染液中浸泡5 min，流水冲洗5 min，冰醋酸分化20～30 s，流水冲洗5 min，风干后浸泡二甲苯两次， 5 min/次，封片，显微镜下观察。

番红O染色：烤箱中预热30 min，脱蜡， 0.02%固绿染液中浸泡5 min， 1%冰醋酸中漂洗1 min， 0.1%番红O 染液中浸泡5 min， 95%酒精浸洗1～2 min，风干后浸泡在二甲苯中2 次， 5 min/次，封片，显微镜下观察。测量番红O染色积分光密度[3]。

1.3 Transwell共培养

在纤连蛋白包被的Transwell小室中(4 μm微孔滤膜，Corning，USA)，上室接种髁突软骨组织块，下室接种3～5 代的BMSCs，孵育48 h后，制取BMSCs细胞爬片，或刮取BMSCs用于提取mRNA。

1.4 免疫荧光染色

烤箱中预热切片30 min，脱蜡。复合消化液孵育10 min，PBS荡洗3×5 min，抗原修复液孵育10 min，PBS荡洗3×5 min， 2%羊血清封闭30 min，滴加一抗， 4 ℃中孵育过夜，次日室温复温30 min，避光滴加荧光二抗， 37 ℃中孵育30 min， 避光滴加1∶800的DAPI， 37 ℃中孵育10 min，防淬灭封片剂封片，共聚焦显微镜下观察。所用一抗包括： c-myc (1∶100， ab32072)、 ERK1/2(1∶100， ab17942，Abcam公司，英国)。

1.5 RNA的提取

捣碎髁突软骨组织，与Trizol裂解液轻轻混匀后冰上静置20 min，加入20 μl氯仿，震荡15 s，室温静置10 min。 12 000 g离心15 min，液体分下层有机相、中间相和上层水相。小心吸取上层水相至另一EP管，加入50 μl异丙醇，混匀，静置20 min， 12 000 g离心15 min，RNA沉淀至管底，弃去上清，加入75%乙醇洗涤RNA， 7 500 g离心10 min，弃去酒精，将EP管倒置于滤纸上使RNA干燥。加入20～30 μl DEPC水使RNA溶解，测定RNA的浓度和A值。

1.6 Realtime-PCR反应

将RNA反转录后在Applied Biosystem 7500 Realtime-PCR仪中(ABI公司，美国)用两步法的扩增程序进行PCR反应，记录目的基因相对于GAPDH的量，将对照组设定为1，记录UAC实验组目的基因相对于对照组的值。每个实验重复反应3次， 3次反应的平均值用于统计分析。所用的Col2a1引物为以往报道过的序列[7]：5′-CATCCAGGGCTCCAATGATGTA-3′ 和5′-ATGTCCATGGGTGCGATGTC-3′。

1.7 统计分析

2 结 果

2.1 UAC致颞下颌关节骨关节炎

HE染色结果显示：对照组髁突软骨厚度正常，软骨细胞排列规则；UAC组髁突软骨变薄，软骨细胞排列不规则，出现裂隙。软骨厚度统计结果显示UAC组软厚度较对照组明显变薄(P<0.05)。番红O染色结果显示：对照组髁突软骨软骨基质染色均匀；UAC组软骨基质分布不均匀。UAC组番红O积分光密度较对照组显著减少(P<0.05)(图 1)。

2.2 2 组BMSCs成软骨分化能力的差异

A: HE对照组; B: HE UAC组; C: 番红O对照组; D: 番红O UAC组; E: 番红O染色统计分析; F: 软骨厚度统计分析

图1 对照组及UAC组髁突HE和番红O染色结果(×200)

A： HE， control; B: HE, UAC group； C： Safranine O, control; D: Safranine O, UAC group; E: Statistic analysis of safranine O staining; F: Statistic analysis of caritilage thickness

Fig 1 The HE and safranine O staining of the condyles in the control and UAC groups (×200)

BMSCs细胞爬片甲苯胺蓝染色结果显示：对照组BMSCs细胞基质未见蓝紫色着色，为甲苯胺蓝染色阴性；和UAC髁突软骨块共培养的BMSCs细胞基质有蓝紫色着色，为甲苯胺蓝染色阳性，说明共培养的BMSCs表达软骨基质成分(图 2)。

Realtime-PCR结果显示：与对照组和UAC组髁突软骨块共培养的BMSCs Col2a1的基因表达水平均较未经过共培养的BMSCs高(P<0.05)，但均较软骨细胞表达水平低(P<0.05)；与UAC组髁突软骨培养的BMSCs Col2a1的基因表达水平较与对照组髁突软骨共培养的低(P<0.05)(图 2)。

2.3 2 组细胞c-myc和ERK1/2的表达水平

图2 各组BMSCs的成软骨分化 (甲苯胺蓝染色， ×200)

Fig 2 Chondrogenic differentiation of BMSCs of the groups (Toluidine blue staining, ×200)

BMSCs细胞爬片免疫荧光结果显示：BMSCs分别与对照组和UAC组髁突软骨细胞块在Transwll系统中共培养后，BMSCs均可表达c-myc和ERK1/2，但UAC组c-myc和ERK1/2阳性细胞比例较对照组低(P<0.05)(图 3)。

3 讨 论

OA的细胞治疗是近几年的研究热点。其中间充质干细胞组织来源丰富，体外自我扩增能力强，可多向分化，被认为是对OA治疗最有优势和应用前景的种子细胞[9]。

图3 2 组细胞c-myc和ERK1/2的表达(免疫荧光染色， *:P<0.05) (×200)

Fig 3 c-myc and ERK1/2 expression of the cells of the 3 gorups(Immunofluorescent staining, *:P<0.05) (×200)

大量的实验表明不需要另外加刺激，体内局部注射的MSCs可自行定向迁移至病变的关节软骨，分泌软骨基质，部分逆转软骨的病变。给猪OA膝关节内注射MSCs，发现MSCs可在膝关节软骨中定植，且表达软骨细胞标记物——II型胶原[4]。课题组前期实验也表明，OA软骨能通过分泌趋化因子诱导局部注射的BMSCs向病变软骨趋化[3]。另外，局部注射的BMSCs可定向迁移至病变髁突，定植于髁突软骨中，并分泌II型胶原，向软骨细胞分化[3，10]。

研究表明体外软骨细胞与MSCs共培养可诱导MSCs成软骨分化。 Meretoja等[11]和Diao等[12]发现关节软骨细胞和MSCs之间的相互作用可诱导MSCs的成软骨分化。 Kubosch等[13]建立BMSCs和软骨细胞共培养体系，可诱导MSCs表达II型胶原的蛋白和mRNA 。 Yang等[14]的研究表明软骨细胞可通过旁分泌模式诱导MSCs表达成软骨分化标记物。 Mo等[15]的研究也显示MSCs与关节软骨细胞共培养可增加软骨细胞软骨外基质分泌量和II型胶原表达量。 但目前，OA和正常软骨诱导MSCs成软骨分化能力的差别还未见报导。本研究表明尽管正常和OA的软骨均可诱导BMSCs成软骨分化，但OA软骨诱导MSCs成软骨分化的能力远不如正常软骨(图 2)。

c-myc和ERK1/2在干细胞的成软骨分化中起着重要作用。用包括c-myc在内的数种基因转染人绒毛膜或者蜕毛干细胞，或者转染鼠的胚胎干细胞，可直接将这些干细胞转变成软骨细胞[4-5]。而抑制BMSCs的ERK1/2信号可明显抑制其表达软骨基质的水平[6-7]。本研究将正常或者OA的软骨细胞与BMSCs共培养，发现2 组均可上调BMSCs的c-myc和ERK1/2表达水平，但与OA的髁突软骨共培养的BMSCs，其c-myc和ERK1/2水平低于与正常髁突软骨共培养组(图 3)。本研究推测，髁突软骨可能分泌可溶性的物质作用于BMSCs，提高BMSCs中c-myc和ERK1/2的表达，但OA髁突分泌的该物质较对照组少。

综上所述，本研究发现OA和正常髁突软骨均可诱导BMSCs成软骨分化，但OA软骨诱导BMSCs成软骨能力较对照组弱，可能与OA髁突软骨诱导BMSCs的c-myc和ERK1/2表达上调幅度较对照组小有关。