环状糊精葡萄糖基转移酶工业生产中发酵染菌(Arthrobacter sp.AMP-5)的分离及16srDNA分析

段梦露，李 皎，邓 媛，毛 勇，杨国武

(陕西省微生物研究所,陕西 西安 710043)

0 前言

β-环糊精( β-cyclodextrin，β-CD) 是由 7 个 D-吡喃葡萄糖基以 α-1，4 葡萄糖苷键连接成的环状低聚糖。它具有中心疏水、外表面亲水的圆台形桶状空间结构，因此能够包埋疏水性分子或者基团从而形成包合物[1]。 经过环糊精包埋以后的分子或基团的理化性质，比如水溶性、稳定性、挥发性等都会发生改变，达到保护、稳定、增溶客体分子的功能，所以β-CD广泛应用于食品、医药、石油、化工、环保等诸多领域[2～4]。

β-CD由β-CGTase作用于淀粉后使葡萄糖基发生转移反应而获得[5]，是具有高附加值的淀粉深加工产物，目前国内主要以玉米淀粉为生产原料。β-CGTase的工业化发酵生产大部分采用嗜碱性芽孢杆菌纯培养完成[6～8]。在生产初期，由于培养条件的强碱性(pH>9)，发酵染菌的几率极低。但是长时间连续生产导致环境中的嗜碱性菌群增加，生产厂家发酵染菌的现象越来越多，杂菌污染可能导致产品酶活降低，产量下降，从而直接影响生产效益，严重的已经发生连续倒罐，生产停滞，严重增加了企业的生产成本和负担[9,10]。

我们团队多年来致力于研究环糊精的工业化生产工艺，研究水平已处于国际领先水平。我们在对生产厂家进行技术服务过程中，在发酵异常的发酵液中分离到了一株在碱性条件下可以和正常生产菌共生的节杆菌，通过16sDNA分析发现该杂菌为节杆菌Arthrobacter sp.AMP-5。对生产过程进行实时监测，发现该菌优先于生产菌进行发酵，形成优势菌群并降低发酵液pH值，进而抑制生产菌的增殖。由于β-CGTase生产属于正压发酵，发酵污染的来源可能是空气过滤系统或菌种污染，因此通过预先鉴定生产菌种以及净化空气过滤系统，可以防止发酵染菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 菌株H02S：从生产厂家发酵异常的发酵液中分离得到嗜碱性蜡状芽孢杆菌：陕西省微生物研究所保藏β-CGTase生产菌种其他试剂购自市售。

1.1.2 主要仪器设备 全自动立式电热压力蒸汽消毒器(YX-400ZN，上海三申医疗器械有限公司)；生物发酵智能控制系统及GUJS-10发酵罐(镇江东方生物工程设备公司)；电热恒温培养箱(GH-600ASB，上海博讯实业有限公司)；恒温培养摇床(ZHWY-2012，上海智诚分析仪器制造有限公司)；聚合酶链式反应仪(S1000，美国bio-rad公司)；水平式核酸电泳槽；紫外仪(WD-9430F，北京六一仪器制造厂)；小型震荡仪(QL-901Vortox, 海门其林贝尔仪器制造有限公司)；精密台式数显pH计(PB-10，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；722N型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 发酵液酶活测定方法 采用碘液法测定β-CGTase 水解活性[11]。取 10 μL发酵液与0.2 mL Tris-HCl缓冲液(pH8.0)混合，再加入0.25%马铃薯淀粉溶液0.2 mL，振荡，于40℃水浴中反应10 min 后，立即置于冰水浴中并加入0.5 molc 醋酸溶液 0.5 mL 终止反应，再加入 3 mL 0. 05 g ·L-1碘液显色，同时以蒸馏水为空白，不加酶液为对照，在700 nm波长下比色。一个酶活力单位定义为每分钟减低 10% 吸光度所需酶量。

一个酶活单位(U)=(a-b)/a×1000×酶液稀释倍数

式中：a 为对照组的吸光度；b为样品的吸光度。

1.2.2 发酵液光密度测定方法 吸取发酵液2 mL，以蒸馏水定容到50 mL，在单色波长600 nm处测得光密度值。

1.2.3 杂菌的筛选和分离 分离培养基：玉米浆(6%)，七水硫酸镁(0.02%)，磷酸氢二钾(0.1%)，马铃薯淀粉(1.5%)，琼脂(2%)，溶解后调pH到7.0，加入无水碳酸钠1%。

筛选培养基：以分离培养基为基础，加入0.03%酚酞。

取发酵液按10的倍数逐级梯度稀释，分别在分离培养基和筛选培养基上进行培养。

1.2.4 采用16srDNA技术进行菌种分析、鉴定 提取菌种的基因组DNA。根据细菌的16S rDNA的保守性，设计通用引物序列为，F：5-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3；R：5- TAC GGC TACCTTGTTACG ACTT-3，以基因组DNA为模板，PCR扩增程序为：95℃热变性5 min；94 ℃/40 s，55℃/40 s，72℃/2 min，40个循环；72℃延伸 10 min，1.0 % 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。目的片段经胶回收和纯化后，连接于 pGM-T 载体上，转化至感受态细胞E．coli DH5α中， 37 ℃培养过夜。挑取单菌落培养并使T7和SP6测序引物进行菌落 PCR验证 。PCR条件：95℃热变性10 min；94℃/1 min，55℃/1 min，72℃/2 min，共 30个循环 ；72℃延伸 10 min。将验证后的阳性克隆子菌液送至杨凌天润奥科生物科技有限公司测序。使用BLAST搜索软件在NCBI的GeneBank基因库中对测序结果进行同源性分析和检索，筛选出与目的菌种相似度匹配最高的种属。

2 结果与讨论

2.1 H02S菌种的分离筛选

对环糊精生产车间中发酵异常的发酵液进行分离筛选， 获得一株可在强碱性(pH>9)的筛选培养基上正常生长的菌种H02S。如图1所示，1为将一片盖玻片置于培养基上，将培养基和pH试纸分离，试纸不变色，进一步证实了本实验试纸的显色是由碱性培养基引起的，与环境因素无关。菌落2为产β-CGTase的正常菌菌落，该菌落可在碱性培养基上正常生长(pH试纸显色为碱性)，且菌落周围产生褪色圈，这是由于正常菌产生的β-CGTase将培养基中的淀粉转化为β-CD，β-CD包埋培养基中的酚酞从而在菌落周围产生了褪色圈。菌落3为分离杂菌H02S，该杂菌虽然可在强碱性培养基上生长(pH试纸显色为碱性)，但不能生产分泌β-CGTase，所以菌落周围无褪色圈。

2.2 H02S菌种的16SrDNA分析

对H02S进行16SrDNA克隆和测序，使用BLAST在GeneBank基因库中进行同源性搜索和多序列比对，如图2所示，经比对H02S应归属于Arthrobacter sp.AMP-5，与正常生产菌种属不同。

2.3 H02S菌种发酵生长曲线

将正常菌和H02S杂菌分别接入10 L全自动发酵罐，以相同培养条件进行发酵，并记录两种菌的发酵生长曲线。如图3所示，在0～8 h之间，两种菌的生长速度几乎相同，随后8～16 h之间杂菌H02S的生长速度高于正常菌，且杂菌在16 h菌体密度达到峰值，而生长至16 h之后，正常菌的菌体密度超过杂菌H02S。由此分析，在工业生产中，如果发酵罐染菌，杂菌会优先于生产菌进行发酵，形成优势菌群从而抑制正常生产菌的生长，导致发酵失败。

2.4 H02S菌种发酵pH值变化曲线

将正常菌和H02S杂菌分别接入10 L全自动发酵罐，以相同培养条件进行发酵，并记录两种菌发酵过程中的pH值变化。如图4所示，两种菌的发酵过程中pH值均呈现先下降后略有上升的趋势。由此分析，在工业生产中可能H02S优先于生产菌进行发酵，使发酵液pH值降低，不利于正常生产菌的增殖，并且增加了污染环境中其他杂菌的可能性。

2.5 H02S菌种发酵过程中的酶活变化

将正常菌和H02S杂菌分别接入10 L全自动发酵罐，以相同培养条件进行发酵，并记录两种菌发酵过程中的酶活的变化。如图5所示，正常生产菌的酶活在28 h达到峰值4 257.41 U·mL-1，而H02S则不产酶。

3 结论

本团队在对β-CGTase生产厂家进行技术服务过程中，在发酵异常的发酵液中分离到了一株在碱性条件下可以和正常生产菌共生的杂菌H02S；对该杂菌进行16srDNA基因分析鉴定，发现该杂菌为节杆菌Arthrobacter sp.AMP-5；将该杂菌与正常生产菌分别进行发酵，在发酵初期杂菌H02S的生长速度明显高于正常菌，同时pH值快速下降，且发酵全程H02S不产酶。根据多年生产经验，由于β-CGTase生产属于正压发酵，发酵污染的来源可能是空气过滤系统或菌种污染，导致了节杆菌优先于正常菌生长，迅速形成优势菌群，消耗大量营养物质，同时降低了发酵液pH值，抑制正常菌的生长导致发酵失败。因此，在工业发酵生产β-CGTase时，应预先采用16srDNA基因序列分析鉴定生产菌种，排除染杂菌的菌种；发酵岗位操作员也应严格执行空消和实消操作，定期排空空气压缩机储罐内积水，对发酵过程中的酶活和pH值进行实时监测，以期及早发现发酵污染，并从源头上消除发酵染菌的可能性。