吡咯喹啉醌对舌鳞状细胞癌细胞上皮间质转化的抑制作用研究

吴南 李斌

1.永州职业技术学院医学院 永州 425000；2.湖南医药学院口腔医学院 怀化 418000

舌鳞状细胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，易发生周围浸润及早期淋巴结转移，严重影响患者的生存周期和生活质量[1]。上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被认为与肿瘤的侵袭和迁移密切相关[2]。吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是一种新有机辅酶，从微生物到人体组织均有广泛的分布，人体可通过饮食获取以满足机体的需要。目前已有研究[3-4]证实，PQQ具有保护神经和心血管系统的作用。随着研究的深入，PQQ亦被发现有良好的抗肿瘤作用[5]，但目前对鳞状细胞癌，特别是TSCC的EMT作用报道较少，其相关机制也未明确。本研究选用TSCC细胞作为实验对象，探讨PQQ对TSCC细胞EMT的作用及可能机制，为PQQ抗肿瘤作用的研究提供理论和实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞系

TSCC细胞株CAL27由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔医学重点实验室惠赠。

1.2 试剂

PQQ（Sigma公司，美国）；DMEM/F12培养液（北京索莱宝科技有限公司）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）、上皮钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、锌指转录因子Snail、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）以及单克隆抗体（CST公司，美国）；β-actin一抗、LaminB多克隆抗体、二抗山羊抗兔等（北京康为世纪生物科技有限公司）；ROS清除剂N-乙酰基-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC；Selleck公司，美国）；NF-κB激动剂佛波醇酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA；MCE公司，美国）。本实验所需实验及设备由湖南医药学院生物研究中心提供。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 CAL27细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。

1.3.2 MTT法检测细胞增殖情况 取对数期生长细胞，以每孔8×103个细胞的密度接种于96孔板内，培养过夜，设置PQQ不同浓度（0.5、2、4、8、16 μmol·L-1）处理组和空白对照组，每组5个复孔，继续培养24 h后，每孔加入5g·L-1的MTT溶液10μL，孵育2h后弃上清液，加入100μL二甲基亚砜，避光振荡30min后于酶联免疫检测仪492nm下测定各孔吸光度值，计算PQQ的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.3.3 Transwell侵袭实验 实验分为空白对照组（不添加PQQ）和PQQ组（1、2、4 μmol·L-1）。Matrigel胶与无血清培养基按质量比1：5混合，取50μL均匀铺在Transwell小室底面，置于培养箱中，待其成凝胶状后进行实验，无血清培养基稀释PQQ使终浓度分别为1、2、4 μmol·L-1，调整CAL27细胞密度约为每毫升4×105个，取500μL接种于小室上室，下室中加入含20%胎牛血清的培养基，继续培养24 h后，取出小室，用棉签擦去上室细胞和Matrigel胶，4 ℃预冷PBS冲洗，甲醇固定15min，再以0.1%的结晶紫染色30min，清洗残余结晶紫，于倒置相差显微镜随机选择4个视野计数细胞，重复3次，拍照，统计分析。

1.3.4 细胞划痕实验 CAL27细胞接种于6孔板内，继续培养待细胞铺满80%，用200μL的细胞刮做划痕，换液拍照。以无血清培养基稀释PQQ，使终浓度为1、2、4 μmol·L-1，加入培养板继续培养24 h，换液拍照。

1.3.5 电子荧光显微镜下检测细胞内ROS水平 以每孔1×104个细胞的密度接种于96孔板，PQQ（0、1、2、4 μmol·L-1）处理细胞24 h后，用5μmol·L-1的2,7-二氯-二氢荧光素二醋酸酯孵育30min，然后弃上清液，用PBS反复清洗3次，对照组及实验组分别加入200µL PBS，于电子荧光显微镜下，激发波长为488 nm、发射波长为525nm检测细胞荧光强度，采用Image J软件进行分析。

1.3.6 Western blot法检测NAC对PQQ调控相关蛋白表达的影响 CAL27细胞以每毫升1×106个的密度接种于6孔板，采用以下不同条件进行处理。空白对照组（培养基处理24 h）、PQQ组（2μmol·L-1PQQ处理细胞24 h）、PQQ+NAC组（1.0mmol·L-1NAC预处理细胞1h后，再加入2μmol·L-1PQQ处理细胞24 h）、NAC组（1.0mmol·L-1NAC预处理细胞1h，培养基处理细胞24 h）。收集各组细胞，加入细胞裂解液，离心收集细胞总蛋白，测定EMT相关蛋白（E-cadherin、Vimentin和Snail）的表达情况，收集细胞核蛋白以检测NF-κB通路活化情况。经蛋白定量后以10%～12%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，5%的牛奶室温封闭2h，用E-cadherin（1：1000）、Vimentin（1：1000）、Snail（1：800）、NF-κB蛋白（1：500）与聚偏二氟乙烯膜一起4 ℃孵育过夜，次日二抗孵育1h，化学发光法显色，于Image Quant LAS-4000mini曝光成像仪中进行分析。

1.3.7 Western blot法检测PMA对PQQ调控相关蛋白表达的影响 CAL27细胞以每毫升1×106个的密度接种于6孔板，采用以下不同条件进行处理。空白对照组（培养基处理24 h）、PQQ组（以2μmol·L-1PQQ处理细胞24 h）、PQQ+PMA组（以100nmol·L-1PMA预处理细胞1h后，再加入2μmol·L-1PQQ处理细胞24 h）、PMA组（100nmol·L-1PMA预处理细胞1h后，培养基处理细胞24 h）。Western blot法检测E-cadherin、Vimentin和Snail的表达情况，步骤与1.3.6相同。

1.4 统计学分析

所有实验结果均为3次独立试验，数据采用均值±标准差表示，用SPSS 19.0软件中单因素方差分析进行统计，采用GraphPad Prism 6.0软件绘图，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

2.1 PQQ对CAL27细胞增殖的影响

CAL27细胞增殖的MTT实验结果见图1。0.5、2、4、8、16 μmol·L-1的PQQ作用24 h后，随着作用浓度的增加，细胞存活率逐渐下降，提示PQQ对CAL27细胞的增殖有不同程度的抑制作用，PQQ作用24 h的IC50=6.69 μmol·L-1。

图1 PQQ对CAL27细胞存活率的影响Fig 1 Effect of PQQ on CAL27cell proliferation

2.2 PQQ对CAL27细胞侵袭和迁移能力的影响

Transwell侵袭实验结果见图2、3。与空白对照组（0μmol·L-1）比较，分别以1、2、4 μmol·L-1PQQ作用CAL27细胞24 h后，细胞数量明显减少（P＜0.001），说明PQQ可以抑制CAL27细胞的侵袭性。细胞划痕实验见图4、5：1、2、4 μmol·L-1PQQ处理24 h后，与空白对照组（0μmol·L-1）比较，CAL27细胞的迁移同样受到明显抑制（P＜0.05）。

图2 Transwell侵袭实验结果 倒置相差显微镜 × 200Fig 2 The results of Transwell assay inverted phase contrast microscope × 200

图3 不同浓度PQQ对CAL27细胞侵袭能力的影响Fig 3 Effect of PQQ at different concentrations on invasiveness of CAL27cells

图4 不同浓度PQQ对CAL27细胞迁移能力的影响Fig 4 Effect of PQQ at different concentrations on migration of CAL-27cells

图5 细胞划痕实验结果 倒置相差显微镜 × 40Fig 5 The results of wound healing test inverted phase contrast microscope × 40

2.3 PQQ对CAL27细胞内ROS表达的影响

电子荧光显微镜下CAL27细胞内ROS的表达见图6。0、1、2、4 μmol·L-1的PQQ分别作用细胞24 h后，各组的平均荧光强度分别为3.80±0.57、15.90±4.13、55.00±6.16、88.10±4.61。与空白对照组比较，2μmol·L-1PQQ作用细胞24 h后，CAL27细胞内平均荧光强度显著增强，提示2μmol·L-1PQQ即可有效地诱导CAL27细胞内ROS的产生（P＜0.001）。

图6 不同浓度PQQ诱导细胞内ROS的产生状况 电子荧光显微镜 × 200Fig 6 Production of intracellular ROS induced by PQQ at different concentrations electron fl uorescence microscope × 200

2.4 ROS清除剂NAC对PQQ调控EMT相关蛋白和NF-κB蛋白表达的影响

Western blot法检测PQQ和NAC对CAL27细胞表达EMT相关蛋白和NF-κB通路蛋白的作用结果见图7、8。与空白对照组比较，2μmol·L-1PQQ作用CAL27细胞24 h，上皮标志蛋白E-cadherin表达上调，间质标志蛋白Vimentin表达下调，转录因子Snail表达下调，NF-κB通路活化水平受抑制，以上差异均有统计学意义（P＜0.001）。PQQ组与PQQ+NAC组比较，PQQ+NAC组E-cadherin表达降低，而Vimentin、Snail表达上升，NF-κB活化水平也升高。该结果提示，经NAC作用后，PQQ原本上调E-cadherin的作用减弱，下调Vimentin和Snail的作用也减弱，类似的，原本抑制NF-κB通路活化水平的作用也减弱（P＜0.01）。

2.5 NF-κB激动剂PMA对PQQ调控EMT相关蛋白表达的影响

Western blot法检测PQQ和PMA对CAL27细胞表达EMT相关蛋白的结果见图9、10。与空白对照组比较，PQQ组E-cadherin表达上调，Vimentin和Snail表达下调，差异均有统计学意义（P＜0.001）。PQQ组与PQQ+PMA组比较，PQQ+PMA组E-cadherin表达降低，而Vimentin、Snail表达上升，提示PMA作用后，PQQ原本上调E-cadherin的作用减弱，下调Vimentin和Snail的作用也减弱（P＜0.05）。

图7 PQQ和NAC作用下，CAL27细胞中EMT相关蛋白和NF-κB表达的Western blot电泳图Fig 7 Under the treatment of PQQ and NAC, Western blot results of EMT-related proteins and NF-κB expression in CAL27cells

图8 PQQ和NAC作用下，CAL27细胞中EMT相关蛋白和NF-κB表达的统计图Fig 8 Under the treatment of PQQ and NAC, statistical results of EMT-related proteins and NF-κB expression in CAL27cells

图9 PQQ和PMA作用下，CAL27细胞中EMT相关蛋白表达的Western blot电泳图Fig 9 Under the treatment of PQQ and PMA, Western blot results of EMT-related proteins expression in CAL27cells

3 讨论

PQQ在动物、植物以及人体组织中广泛存在，是一种重要的维生素类物质。目前的研究主要集中在PQQ作为心脏和神经保护剂[3]以及对造血系统的放射防护作用等方面[6]。在肿瘤研究方面，PQQ已经证实对胰腺癌、恶性黑色素瘤等恶性肿瘤有明显的抑制作用[7-8]，但是关于PQQ对TSCC的侵袭和转移的报道尚不多见，也未见相关机制的阐述。本研究以TSCC细胞株CAL27为研究对象，探讨PQQ的作用，结果发现，随着PQQ作用浓度的增加，CAL27细胞增殖能被有效抑制，且PQQ处理后，CAL27细胞的侵袭和迁移能力均受到抑制。此外，本研究还发现，PQQ能够调控EMT相关蛋白的表达，包括上调上皮标志蛋白E-cadherin，下调间质标志蛋白Vimentin和锌指转录因子Snail的表达，提示PQQ能抑制TSCC的EMT进程。

图10 PQQ和PMA作用下，CAL27细胞中EMT相关蛋白表达的统计图Fig 10 Under the treatment of PQQ and PMA, statistical results of EMT-related proteins expression in CAL27cells

ROS与肿瘤的关系存在两面性。一方面，低水平的ROS能增加细胞基因的不稳定性，最终诱导肿瘤的发生和发展[9]；另一方面，急性、高水平的ROS能够损伤肿瘤细胞的DNA，诱导肿瘤细胞凋亡。肿瘤细胞自身抗氧化损伤防御系统缺陷和对ROS存在易感性均提示ROS在杀伤肿瘤方面具有积极的一面[10]。研究[11]表明，PQQ具有良好的抗肿瘤作用与其能诱导癌细胞内产生ROS有关，升高的ROS能有效杀伤癌细胞。本研究亦发现，TSCC经PQQ的作用可以有效诱导肿瘤细胞内的ROS产生，而升高的ROS能够打破肿瘤细胞内的氧化还原平衡，调控其下游相关信号分子。NF-κB通路作为与肿瘤相关的细胞因子，广泛参与肿瘤的增殖、侵袭和转移等[12-13]。研究[14]证实，NF-κB核转位水平的升高，能促进非小细胞肺癌、胰腺癌等肿瘤的EMT进程，促进肿瘤的发展。目前，关于ROS与NF-κB通路的关系存在一定的分歧。Wu等[15]的研究发现，ROS水平升高能够促进NF-κB通路的活化水平；而Shanmugam等[16]则证实，二甲氨基小白菊内酯可诱导胰腺癌细胞内ROS的产生，抑制NF-κB通路的活化水平。本研究在用ROS清除剂NAC处理CAL27细胞后发现，NAC+PQQ组与PQQ单独处理组比较，PQQ原本上调上皮标志蛋白E-cadherin的作用减弱，下调间质标志蛋白Vimentin和锌指转录因子Snail的作用也减弱，原本抑制NF-κB通路活化水平的作用同样也减弱。该结果提示PQQ产生的ROS能抑制TSCC细胞的EMT进程，其产生的ROS可能通过抑制NF-κB通路的活性发挥抗癌作用。进一步应用NF-κB激动剂PMA观察PQQ的作用，经PMA处理后，原本PQQ上调上皮标志蛋白E-cadherin的作用减弱，下调间质标志蛋白Vimentin和锌指转录因子Snail的表达也减弱，说明PQQ可通过抑制NF-κB通路的活化水平进而达到抑制TSCC细胞EMT的作用。

综上所述，PQQ可以诱导TSCC细胞提高ROS的表达水平，其产生的ROS可通过下调NF-κB通路的活化水平而达到抑制TSCC细胞EMT进程的效果，该结果为PQQ逆转TSCC细胞的EMT进程提供了理论依据。因为ROS水平对肿瘤的作用效果存在两面性，如何调控PQQ诱导肿瘤细胞内ROS水平，积极利用ROS有益的一面仍是今后需要深入探讨的方向。