低浓度苯和甲醛经呼吸道联合染毒对小鼠肝脏毒性研究

邹丽君，张 娟，高艳芳，胡恭华

(赣南医学院基础医学院预防医学系，江西 赣州 341000)

苯和甲醛是典型的职业环境污染物和室内空气污染物[1]，引发的健康问题也成为国内外学者的研究热点。苯和甲醛均是人类确认的致癌物，两种毒物长期高浓度接触可导致肝肾、造血系统、神经系统、生殖系统等多种健康损害[2-4]，目前的研究多集中于苯和甲醛各自的健康损害及相关机制，两种毒物的联合作用且低浓度、短时间的毒性作用研究较少，本文拟通过对ICR小鼠进行苯和甲醛低浓度、短时间的联合暴露来探讨肝脏毒性，为相关研究提供一定的基础资料。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF级雌性ICR小鼠54只，平均体重26.56 g[购自湖南斯克景达实验有限公司，生产许可证号：SCXK(湘)2016-0002，使用许可证编号SYXK(赣)2018-0004]。屏障环境饲养和染毒，温度18～24 ℃，湿度为40%～60%。

1.2仪器和试剂55 L静式染毒柜(实验室自制，塑料材质、可密封、透明)，Sorvall ST 8R型高速冷冻式离心机(美国Thermo Fisher)，EON-EPOCH酶标仪(美国Biotek)，ZXDP-R2800电热恒温培养箱(上海智城)，玻璃匀浆器；苯(分析纯，国药集团)，37%甲醛水溶液(分析纯，国药集团)，0.01 M PBS缓存液，CHO测试盒、TG测试盒、ALT测试盒、AST测试盒、SOD测试盒和MDA测试盒(南京建成)。

1.3实验方法

1.3.1分组和染毒54只SPF级雌性ICR小鼠随机分组均分9组，依次分为G1(空白对照组)、G2(低苯组，苯剂量12 mg·m-3)、G3(高苯组，苯剂量60 mg·m-3)、G4(低甲醛组，甲醛剂量2 mg·m-3)、G5(高甲醛组，甲醛剂量10 mg·m-3)、G6(低苯+低甲醛组，苯剂量12 mg·m-3+甲醛剂量2 mg·m-3)、G7(高苯+低甲醛组，苯剂量60 mg·m-3+甲醛剂量2 mg·m-3)、G8(低苯+高甲醛组，苯剂量12 mg·m-3+甲醛剂量10 mg·m-3)、G9(高苯+高甲醛组，苯剂量60 mg·m-3+甲醛剂量10 mg·m-3)，每组6只，呼吸道静式染毒，连续染毒14天，2小时/天(中间间隔一小时)。染毒期间禁食禁水，其余时间自由饮水摄食，每7天测量一次体重。

1.3.2血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)测定染毒结束，10%水合氯醛麻醉小鼠后摘眼球取血，5分钟2 000 rmp离心分离血清，按照试剂盒的说明书测定和计算ALT和AST。

1.3.3肝脏组织超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量测定染毒结束处死小鼠，解剖分离肝脏，称量约0.1 g肝脏组织与PBS缓冲液按1∶9用玻璃匀浆器制备10%肝匀浆，10分钟3 000 rmp离心，取上清液按照试剂盒说明书测定和计算测定肝脏组织SOD活力和MDA含量。

1.3.4血清总胆固醇(CHO)和血清甘油三酯(TG)测定染毒结束，10%水合氯醛麻醉小鼠后摘眼球取血，5分钟2 000 rmp离心分离血清，按照试剂盒说明书测定和计算CHO和TG。

2 结 果

2.1苯和甲醛联合染毒14天小鼠体重变化情况苯不同剂量组小鼠体重增长不同，差异有统计学意义(P<0.05)，甲醛不同剂量组的体重增长呈现剂量越高增长越缓慢趋势，但差异无统计学意义，苯和甲醛联合染毒对小鼠的体重增长有交互作用，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1、2。

表1 苯和甲醛联合染毒14天小鼠体重变化情况

表2 各组小鼠体重增长的方差分析结果

2.2苯和甲醛联合染毒14天对小鼠ALT和AST的影响各处理组的ALT差异无统计学意义，无主效应及交互作用；而AST无主效应但呈现交互作用，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、4。

表3 苯和甲醛联合染毒14天对小鼠ALT和AST的影响

表4 各组小鼠ALT、AST方差分析结果

2.3苯和甲醛联合染毒14天对小鼠SOD活力和MDA含量的影响各处理组的肝组织SOD活力随染毒剂量增加有下调趋势，但无统计学意义；苯不同剂量组MDA含量不同，差异有统计学意义(P<0.05)，甲醛不同剂量组MDA含量不同，差异有统计学意义(P<0.05)，苯和甲醛联合染毒有交互作用，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5、6。

表5 苯和甲醛联合染毒14天对小鼠SOD活力和MDA含量的影响

表6 各组小鼠SOD活力、MDA含量方差分析结果

2.4苯和甲醛联合染毒14天对小鼠CHO和TG的影响各处理组的CHO差异无统计学意义，无主效应及交互作用。苯不同剂量组TG不同，差异有统计学意义(P<0.05)，甲醛不同剂量组TG差异无统计学意义，苯和甲醛联合染毒对TG有交互作用，差异有统计学意义(P<0.05)。见表7、8。

表7 苯和甲醛联合染毒14天对小鼠CHO和TG的影响

表8 各组小鼠CHO、TG方差分析结果

3 讨 论

苯和甲醛作为人类确认的致癌物和致突变物，经常联合暴露于职业环境和室内空气环境，如化工行业中用于原料生产各类化工产品、作为溶剂和助剂用于喷漆印刷行业和家居装修材料等。随着国家职业卫生标准和环境卫生标准的推广实施，职业环境和室内空气环境中两者的暴露通常在较低的水平，在这种情况下，两者是否存在联合作用、其健康损害呈现何种特征是一个新的命题。根据我国职业接触限值苯(PC-STEL：10 mg·m-3)及甲醛(MAC：0.5 mg·m-3)[5]，我们将本次苯和甲醛经呼吸道染毒的剂量分别设置为0、12、60 mg·m-3和0、2、10 mg·m-3，按两因素三水平的析因设计组合为9个不同染毒剂量组，对ICR小鼠进行14天单独染毒与联合染毒(2 h/天)，基本符合低浓度、短时间的联合暴露。

从染毒期间小鼠体重变化的析因分析结果来看，苯不同剂量组小鼠体重增长不同，差异有统计学意义(P<0.05)，甲醛不同剂量组的体重增长呈现剂量越高增长越缓慢趋势，但差异无统计学意义，说明该剂量下的苯对小鼠体重的影响要高于甲醛，苯和甲醛联合吸入染毒对小鼠的体重增长有交互作用，差异有统计学意义(P<0.05)，表现为低剂量联合组体重增长较少，高剂量联合组体重增长较多，说明该剂量下的苯对小鼠体重的影响要高于甲醛，联合染毒时甲醛的暴露抵消了苯对体重的影响。肝脏是机体最大的代谢器官，肝功能的变化可以表征毒物的毒作用特点并为毒作用机制研究提供线索。ALT和AST这两种转氨酶是代表肝功能的生物标志物，ALT主要集中在肝脏，AST分布更广泛，转氨酶的升高说明肝功能可能发生损伤。我们的实验结果显示各处理组的ALT变化无统计学意义，而苯和甲醛对AST呈现交互作用，差异有统计学意义(P<0.05)，高剂量联合染毒组AST水平较低，提示该剂量下的AST变化可能来自于肝脏或者其他系统的损伤，且联合暴露的效应与单独暴露不同。SOD 是抗氧化系统中重要的酶类, 能特异地捕获体内生成的 O2-·，MDA 是脂质过氧化的中间产物, 是机体氧化损伤的标志物，已有研究证实苯与甲醛单独染毒或联合染毒在多种器官中都能发现SOD活力和MDA含量的变化，并呈现剂量反应关系[6-7]。我们的实验结果显示，各处理组的肝脏SOD活力随染毒剂量增加有下调趋势，但差异无统计学意义；苯不同剂量组MDA含量不同，差异有统计学意义(P<0.05)，甲醛不同剂量组MDA含量不同，差异有统计学意义(P<0.05)，苯和甲醛联合染毒有交互作用，差异有统计学意义(P<0.05)，低剂量联合染毒组MDA含量升高，高剂量联合染毒MDA含量降低，且联合染毒各组均高于单独染毒。各处理组的SOD变化没有统计学差异说明该剂量下动物的抗氧化酶类还没有显著性改变，但MDA的结果说明该剂量下的苯和甲醛的暴露已出现肝脏氧化损伤，且联合毒性更大，存在交互作用，结合其他相关文献来看[8-9]，在剂量更高、时间更长的情况下，抗氧化酶类和氧化反应产物都有显著性改变，提示低剂量下氧化反应产物变化可能早于抗氧化酶类，表现更灵敏。内源性血脂主要是在机体的肝脏、脂肪等组织细胞合成，血脂作为评价脂代谢功能的重要指标，可以反映肝脏的代谢功能。从本次实验的血脂结果来看，各处理组的CHO差异无统计学意义，无主效应及交互作用。TG表现为苯不同剂量组变化不同，差异有统计学意义(P<0.05)，甲醛不同剂量组差异无统计学意义，苯和甲醛联合染毒有交互作用，差异有统计学意义(P<0.05)，低剂量联合染毒显示TG升高较明显，但各联合染毒组均低于低剂量苯组，说明该剂量下的苯对小鼠TG的影响要高于甲醛，联合染毒时甲醛的暴露抵消了苯对TG的影响。

综上所述，低浓度、短时间的苯和甲醛联合暴露对ICR小鼠的体重增长有影响，存在系统毒性，结合AST、TG、MDA的变化来看，可以推测该剂量下的暴露可导致肝脏等多种脏器的损伤。从动物实验结果来看，苯的肝脏毒性更明显，多个指标在苯不同剂量组有差异，提示目前苯的PC-STEL值接近健康损害阈值，存在一定风险。苯和甲醛联合染毒有交互作用，表现为低剂量联合毒效应增强，高剂量联合毒效应降低，有可能是低剂量的联合暴露导致动物的低剂量保护效应，各项指标都代偿性升高，但考虑到样本量和实验的稳定性，其交互作用具体为拮抗还是协同作用有待进一步研究。