RIP1介导的坏死性凋亡通过NF-κB通路调节肾小管上皮细胞炎症反应*

方晓旭，杜春阳，宋 珊，史永红，任韫卓，段惠军

（河北医科大学病理教研室，河北石家庄050017）

慢性肾脏疾病（chronic kidney disease，CKD）的发生率持续升高，并且严重影响患者的生活质量，肾脏持续的炎症反应与CKD的发生发展密切相关[1]。坏死性凋亡（necroptosis）是细胞程序性死亡的一种新形式[2]，同时具有坏死和凋亡的特征，它是由受体相互作用蛋白（receptor-interacting protein，RIP）调控的非caspase依赖性的细胞死亡模式，其中，RIP1在坏死性凋亡信号转导中起到了关键作用。在疾病等机体异常状态下，caspase-8生成显著增多，启动了机体的凋亡信号通路。Z-VAD-FMK是一种泛caspase抑制剂[3]，它可以完全抑制RIP1介导的procaspase-8蛋白水解活化，使机体凋亡信号通路被阻断，进而使凋亡转化为坏死性凋亡。不同的刺激与坏死性凋亡有关，最具特征的是肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），TNF-α联合Z-VAD-FMK（T/Z）是诱导坏死性凋亡的经典模型[4-5]。新近研究发现，坏死性凋亡参与了急性胰腺炎[6]、肝炎[7]及克罗恩病[8]的炎症反应，但在肾小管上皮细胞中，坏死性凋亡与炎症关系如何，目前尚不清楚。我们在前期研究中发现，坏死性凋亡抑制剂necrostatin-1（Nec-1）能够减轻单侧输尿管梗阻小鼠的肾脏炎症反应[9]，提示坏死性凋亡在肾小管细胞的炎症反应中具有关键调控作用，但具体的调控机制还未明确。吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（ammonium pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC）是一种选择性核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）抑制剂和抗氧化剂[10-11]，可以抑制许多细胞类型中NF-κB的活化，进而抑制NF-κB通路。本研究在前期实验基础上，采用T/Z刺激体外培养的肾小管上皮细胞，构建坏死性凋亡的细胞模型；进一步用Nec-1和PDTC干预细胞，深入探讨坏死性凋亡对T/Z刺激的肾小管上皮细胞炎症反应的调控机制。

材料和方法

1 细胞

人肾小管上皮HK-2细胞购自美国标准生物品收藏中心。低糖型DMEM培养基和DMEM/F12培养基1∶1配制，常规培养。分别给予HK-2细胞TNF-α（50 μg/L）、Z-VAD-FMK（50 μmol/L）、Nec-1（50 μmol/L）和PDTC（20 μmol/L）处理，于24 h后收集细胞观察，重复细胞实验5次。

2 主要药品与试剂

TNF-α购自 PeproTech；Z-VAD-FMK和 Nec-1购自MCE；PDTC购自Abcam；RIP1过表达质粒由Addgene公司惠赠；鼠源抗 RIP1、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκB激酶（IκB kinase，IKK）、白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和单核细胞趋化蛋白 1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）多克隆抗体购自Abcam；兔源多克隆抗caspase-3抗体购自Cell Signaling Technology；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）细胞毒性检测试剂盒购自Promega；Lipofectamine 3000转染试剂盒和Opti-MEM培养基购自Thermo Fisher；IL-1β和MCP-1 ELISA试剂盒购自武汉六合生物公司；反转录试剂盒购自Promega；Real-time PCR SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒购自TaKaRa。

3 主要方法

3.1 Western blot检测蛋白水平 细胞用冰冷的PBS洗2遍，然后加入200 μL预冷的RIPA蛋白裂解缓冲液，冰浴30 min，用细胞刮均匀刮起细胞，收集到1.5 mL的EP管内，4℃、12 000 r/min离心25 min，BCA法测定上清液蛋白浓度。按每孔30 μg细胞裂解蛋白上样，SDS-PAGE分离，将蛋白转至PVDF膜上；5%脱脂奶粉37℃孵育1 h封闭PVDF膜，加入抗RIP1（1∶1 000）、caspase-3（1∶800）、IKK-α（1∶5 000）、NF-κB p65（1∶900）、p-NF-κB p65（1∶1 000）、IL-1β（1∶1 000）和MCP-1（1∶1 000）抗体，4℃过夜；室温孵育1 h，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠或山羊抗兔II抗（1∶5 000稀释），37℃孵育1.5 h；洗膜后加入Pro-light HRP化学发光试剂，Odyssey Fc成像系统显影，用UVP LabWorks 4.5分析软件对Western blot条带进行定量分析。

3.2 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）细胞毒性检测 HK-2细胞接种于96孔板，刺激24 h后，收集细胞培养基上清，250×g离心4 min，分别取50 μL上清液于新的96孔板中，在各孔中加入50 μL CytoTox 96室温避光孵育30min后，再加入50 μL终止液，用酶标仪于490 nm波长处检测吸光度（A）值，LDH从细胞内的释放量用细胞坏死百分比表示。

3.3 细胞转染 构建RIP1过表达质粒，待细胞密度60%～70%进行转染，准备A、B两个2 mL的EP管，A管中加入125 μL Opti-MEM培养基和5 μL Lipofectamine 3000 Reagent，B 管 中 加 入 125 μL Opti-MEM培养基、5 μL P3000 Reagent及1 μg RIP1质粒，A、B管混匀，于细胞超净台上放置5 min，将混合液加入细胞培养皿中，转染6 h做后续处理。

3.4 ELISA测定 收集细胞培养基，1 000×g离心25 min，各取50 μL上清于ELISA板中，再在每孔中加入100 μL辣根过氧化物酶标记的检测抗体，密封条件下，37℃孵育60 min。弃去孔内液体，用洗涤液重复洗5次，再向每孔中加入50 μL底物A、B，37℃避光孵育15 min。在每孔中加入50 μL终止液，在450 nm波长处测定每孔的A值。

3.5 real-time PCR TRIzol法提取细胞总RNA后按试剂盒步骤反转录为cDNA。实时定量PCR采用20 μL反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各0.8 μL，ddH2O 6 μL。反应条件为：95℃ 30 s；95℃5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环。使用3个复孔的Ct值取平均值，采用公式2-ΔΔCt计算mRNA表达的相对倍数变化。

4 统计学处理

用SPSS 21.0软件进行统计学分析，数据均采用均数±标准差（mean±SD）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 T/Z条件下RIP1介导HK-2细胞坏死性凋亡

Western blot结果显示，T组HK-2细胞坏死性凋亡相关指标RIP1和凋亡相关指标cleaved caspase-3的蛋白水平均增加，T/Z组RIP1的蛋白水平进一步增加，而cleaved caspase-3的蛋白水平降低（P＜0.01），见图1A。LDH细胞毒性实验结果显示，与control组相比，T组HK-2细胞坏死百分比显著增加（P＜0.05），T/Z组细胞坏死百分比进一步增加（P＜0.01）；与T/Z组相比，再加入Nec-1干预后（T/Z+N组）细胞坏死百分比显著下降到（P＜0.01），见图1B。上述结果提示T/Z可以诱导HK-2细胞发生坏死性凋亡。

Western blot结果显示，与control组相比，转染RIP1过表达质粒（RIP1+）组HK-2细胞中RIP1的蛋白表达水平明显增高，见图1C。转染RIP1过表达质粒后，T/Z条件下（T/Z+RIP1+组）的HK-2细胞坏死百分比进一步增加（P＜0.01），见图1D。上述结果提示RIP1介导了T/Z条件下HK-2细胞的坏死性凋亡。

2 T/Z条件下RIP1介导的坏死性凋亡对HK-2细胞IL-1β和MCP-1蛋白水平的影响

Western blot及ELISA结果显示，与control组相比，T/Z组HK-2细胞的IL-1β和MCP-1蛋白水平增高；与T/Z组相比，Nec-1干预下调IL-1β和MCP-1的蛋白水平；反之，转染RIP1过表达质粒明显上调IL-1β和MCP-1的蛋白水平（P＜0.01），见图2。

3 T/Z条件下RIP1介导的坏死性凋亡对HK-2细胞NF-κB通路的影响

Western blot结果显示，与control组相比，T/Z组HK-2细胞中NF-κB通路相关蛋白IKK-α和NF-κB p65的水平增高，同时p-NF-κB p65蛋白水平也增高，再给予Nec-1干预则上述蛋白水平降低（P＜0.01）；与T/Z组相比，转染RIP1过表达质粒可明显上调HK-2细胞中上述蛋白的水平（P＜0.01），见图3A。real-time PCR结果显示，与control组相比，T/Z组HK-2细胞中NF-κB的mRNA表达水平增高，再给予Nec-1干预则NF-κB的mRNA表达水平下降（P＜0.01）；与T/Z组相比，转染RIP1过表达质粒可明显上调HK-2细胞中NF-κB的 mRNA表达水平（P＜0.01），见图3B。这提示在T/Z条件下，RIP1介导的HK-2细胞坏死性凋亡激活了NF-κB通路。

4 T/Z条件下NF-κB通路参与RIP1介导的HK-2细胞炎症

Western blot结果显示，与control组相比，T/Z组HK-2细胞中 NF-κB 通路相关蛋白 IKK-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65及下游分子IL-1β和MCP-1的水平增高，再给予PDTC干预后（T/Z+P组），上述蛋白水平降低（P＜0.01）；PDTC和Nec-1联合干预HK-2细胞后（T/Z+P/N组），上述蛋白水平降低更明显（P＜0.01），见图4。这提示在T/Z条件下，NF-κB通路可能参与RIP1介导的HK-2细胞炎症。

讨 论

Figure 1.RIP1 mediated necroptosis of HK-2 cells under T/Z condition.A：Western blot was used to determine the protein levels of RIP1 and caspase-3；B：the release rate of LDH under T/Z and T/Z+N conditions；C：Western blot analysis of transfection of RIP1 over-expression plasmid in the HK-2 cells；D：the release rate of LDH in T/Z-treated cells with or without RIP1 over-expression.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs T group；&&P＜0.01 vs T/Z group.图1 T/Z条件下RIP1介导HK-2细胞坏死性凋亡

Figure 2.The relationship between RIP1-mediated necroptosis of HK-2 cells and inflammation under T/Z condition.A：the levels of IL-1β and MCP-1 in the supernatant were measured by ELISA；B：Western blot results showed IL-1β and MCP-1 levels in cells.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs T/Z group.图2 T/Z条件下RIP1介导的HK-2细胞坏死性凋亡和炎症的关系

Figure 3.The relationship between RIP1-mediated necroptosis of HK-2 cells and NF-κB pathway under T/Z conditions.A：NF-κB pathway-related proteins were determined by Western blot；B：the mRNA expression of NF-κB was detected by real-time PCR.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs control group；&P＜0.05，&&P＜0.01 vs T/Z group.图3 T/Z条件下RIP1介导的HK-2细胞坏死性凋亡和NF-κB通路的关系

Figure 4.NF-κB pathway was involved in RIP1-mediated HK-2 cell inflammation under T/Z condition.The protein levels of NF-κB pathway-related molecules in the HK-2 cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=5.**P＜0.01 vs control group；&&P＜0.01 vs T/Z group；++P＜0.01 vs T/Z+P group.图4 T/Z条件下NF-κB通路参与RIP1介导的HK-2细胞炎症

坏死性凋亡是一种受调节的细胞死亡类型，其与坏死具有相似的形态学特征（早期包膜完整性破坏，细胞体积及胞内细胞器肿胀）[2]，而坏死是一种被动的，不受管制的细胞死亡形式。在质膜透化后，一般FasL/TNF通过激活Fas/TNFR1死亡结构域，相继形成RIP1的TNFR复合体Ⅰ和TNFR复合体Ⅱ，继而活化caspase级联反应而启动常规的细胞凋亡。但在此途径中TNFR复合体Ⅱ中的RIP1会与RIP3紧密结合并相互磷酸化，活化的RIP3进一步导致其底物混合谱系激酶结构域样蛋白磷酸化[12]，触发细胞通透化和细胞破坏，继而启动坏死性凋亡。T/Z是经典的坏死性凋亡模型[4-5]。Z-VAD-FMK是一个泛caspase抑制剂，TNF-α诱导的procaspase-8蛋白水解活化被Z-VAD-FMK完全抑制，使得RIP1的裂解减少，进而使细胞发生坏死性凋亡。LDH是一种极为稳定的细胞质酶，存在于正常细胞的胞质中，正常时不能通过细胞膜，当细胞受损或死亡时可释放到细胞外，所以细胞死亡数目与细胞培养上清中的LDH活性成正比。本研究发现单独给予HK-2细胞TNF-α刺激，可以同时发生坏死性凋亡和凋亡，TNF-α和Z-VAD-FMK联合刺激HK-2细胞，凋亡途径受到抑制，坏死性凋亡途径被激活；进一步转染RIP1过表达质粒，T/Z+RIP1+组与T/Z组相比HK-2细胞坏死百分比显著升高，提示T/Z条件下RIP1介导了HK-2细胞坏死性凋亡。

坏死性凋亡参与多种疾病炎症的发生，如心力衰竭[13]、克罗恩病[8]、肝炎[7]、急性胰腺炎[6]、急性肾损伤[14]、顺铂治疗小鼠的肾功能障碍[15]及糖尿病心肌病[16]等。本研究发现TNF-α和Z-VAD-FMK联合刺激HK-2细胞后IL-1β和MCP-1的表达水平均有明显提高，提示在T/Z条件下，RIP1介导的HK-2细胞坏死性凋亡的发生与炎症有关，但坏死性凋亡调节炎症的机制报道尚少。

Nec-1是一种有效的RIP1抑制剂[17-18]，能够抑制RIP1的活化，并随后阻断坏死体的形成，最终阻断坏死性凋亡。本研究发现给予T/Z组HK-2细胞Nec-1干预后细胞坏死百分比显著减少，NF-κB的mRNA表达水平下降，NF-κB通路相关蛋白IKK-α、NF-κB p65和p-NF-κB p65的蛋白水平也明显降低，提示在T/Z条件下，RIP1介导的HK-2细胞坏死性凋亡激活了NF-κB通路。

PDTC是NF-κB的特异性抑制剂[10-11]，可通过抑制NF-κB p65亚单位或IκB的降解来抑制NF-κB的激活。我们进一步给予T/Z组HK-2细胞PDTC干预，NF-κB 通路相关蛋白 IKK-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IL-1β和 MCP-1的蛋白水平降低，Nec-1和PDTC联合干预HK-2细胞，对上述指标的抑制程度更显著。这提示在T/Z条件下，NF-κB通路可能参与RIP1介导的HK-2细胞炎症。

综上所述，RIP1介导的坏死性凋亡可以诱导肾小管上皮细胞发生炎症反应；NF-κB通路可能参与这一过程，抑制NF-κB通路可以减轻RIP1介导的坏死性凋亡引发的肾小管炎症反应。这些结果可为慢性肾脏疾病的治疗提供新的思路。