基于ITS序列构建系统发育树鉴定市售黄芪饮片基源的研究Δ

刘建军，黄世锋，代文婷，翟丹丹，宗 凯

(1.合肥市第二人民医院药学部，安徽 合肥 230011； 2.中华人民共和国合肥海关技术中心，安徽 合肥 230022)

黄芪药用始载于《神农本草经》，为“补药之长”，至今已有2 000多年的药用历史[1]。明代李时珍在《本草纲目》中记载，黄芪能补诸虚不足，助气壮筋骨，止腹痛泄痢[2]。《中华人民共和国药典：一部》(2015年版)收录了蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao和膜荚黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. 的干燥根为药用[3]。研究结果表明，不同基源、产地及生长年限的黄芪药材，其化学成分存在显著的差异[4]。从黄芪中分离得到多种化学活性成分，对机体心血管系统、免疫系统等的效果显著，具有良好的抗肿瘤、抗疲劳和抗衰老作用[5]。

黄芪属是一个多态性类群，种类繁多，变异较大，全世界有11个亚属2 500多种，主要分布于北半球的温带地区和南美洲，中亚和西亚也有广泛分布[6]。虽然蒙古黄芪和膜荚黄芪在植物形态上存在一定差异，但两者的药材或饮片难以区别，仅依赖形态学、组织学和化学成分分析等方法来鉴定存在主观性较大、特异性不强以及对观察者经验要求高等缺陷，不利于规范化、标准化方法的建立及普及[7]。为了更好地利用中药资源，近年来分子鉴定方法开始应用于中药鉴定。DNA分子遗传标记技术具有快速、微量和特异性强的特点，该技术的研究和应用为解决药材的鉴别问题提供了客观而有效的手段[8]。内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)序列为一段核糖体非编码序列，具有核苷酸序列上的高度变异性，又具有长度上的保守性，非常适用于易混淆生药品种及近缘生药品种的鉴定[9-10]。已有研究采用该技术评价不同产地的蒙古黄芪ITS序列的变化[11]、黄芪与其伪品的ITS序列分子鉴定[12]以及蒙古黄芪和膜荚黄芪的鉴别[13]。为了寻找新的快速、准确区分蒙古黄芪和膜荚黄芪的方法，本研究通过比对黄芪ITS全序列筛选出单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)差异位点并设计引物，通过对两种黄芪ITS序列差异分析构建系统发育树，进而为鉴别市售黄芪饮片的基源提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器：NanoDrop 2000型核酸蛋白分析仪(Thermo Scientific公司)。

1.1.2 药材与试剂：(1)药材。蒙古黄芪植物样品分别采集自甘肃、河北和内蒙古(编号H-mg-1至H-mg-12号)，蒙古黄芪对照药材(120974-201311和120974-201110，编号S-mg-8和S-mg-9)购自中国食品药品检定研究院；膜荚黄芪植物样品采集自河北和甘肃(编号H-mj-9至H-mj-14)，膜荚黄芪对照药材(121462-201003和121462-201304，编号S-mj-11和S-mj-12)购自中国食品药品检定研究院。所有植物样品均由河北省邯郸市药品检验所的孔增科教授和亳州市药监局孙全峰副主任中药师鉴定。1—16号黄芪饮片均采集自合肥市地区医疗机构中药房，编号为P-1至P-16。(2)试剂。磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒(珠海宝锐生物公司)；2×Taq DNA Master Mix(TAKARA公司)。

1.2 方法

1.2.1 总DNA提取：采用磁珠法提取总DNA。取黄芪药材适量，粉碎后取5 mg置于1.5 ml离心管中，按照磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒的说明书操作，使用NanoDrop 2000型蛋白核酸分析仪测定样品DNA的光密度，-20 ℃下保存备用。

1.2.2 引物设计与合成：选择GenBank数据库中已提交的黄芪ITS全序列，如GenBank登录号为膜荚黄芪JX017320.1、蒙古黄芪KJ999353.1，设计通用引物后对待测样品进行扩增[12]。蒙古黄芪和膜荚黄芪通用检测引物见表1。

表1 蒙古黄芪和膜荚黄芪特异性检测引物

1.2.3 DNA扩增、测序和比对分析：(1)ITS通用引物的扩增条件为，反应体系总体积为20 μl，包括商品化的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)体系2×Taq DNA Master Mix(TAKARA公司)10 μl，上下游引物各1 μl(10 pmol)，模板DNA 2 μl，ddH2O 6 μl。(2)反应条件为，预变性温度95 ℃，时间为5 min；变性温度为95 ℃，时间为30 s；退火温度为52 ℃，时间为30 s；复性温度为72 ℃，时间为30 s；延伸温度为72 ℃，时间为7 min；循环次数为30次，最后于4 ℃下保存。ITS通用引物扩增后进行电泳分析，PCR产物送南京金斯瑞公司测序。测序结果采用Clustal X软件进行比对分析，MEGA 6.0软件中的邻位相连(neighbor-joining，NJ)法构建系统发育树，采用最大复合似然法(maximum composite likelihood，MCL)构建模型，使用1 000次重复检测的Bootstrap值表示树上各节点的支持率。

1.2.4 市售黄芪饮片的基源分析：利用已知黄芪标准品构建的系统发育树群体，将市售黄芪饮片样品ITS基因测序结果导入系统发育树进行分类和鉴定。

2 结果

2.1 黄芪药材ITS全序列结果分析

黄芪ITS全序列(G+C)%含量约65%。序列比对结果表明，蒙古黄芪和膜荚黄芪ITS序列同源性极高，22份黄芪样品在整个ITS全序列区域仅存在几个碱基突变类型，在第1位碱基上均为A，在第128位碱基上有G/A突变，第619位碱基上有G/-/T/C突变，第620位碱基上有T/C突变，第621位碱基上有C/A突变，第622位碱基上有A/-/C突变，第623位碱基上有C/A/-突变，见表2。

2.2 黄芪的遗传距离及系统发育分析

采用MEGA 6.0软件将上述22份已知黄芪药材的序列用NJ法构建系统发育树，见图1。结果表明，22份样本聚类后可分为两大组，第1组为膜荚黄芪，第2组为蒙古黄芪。由图1可见，通过系统发育树可以区分膜荚黄芪和蒙古黄芪的遗传进化关系，进而为其鉴定提供依据。

表2 14份蒙古黄芪和8份膜荚黄芪样本ITS全序列SNP位点

注：“-”表示该位点缺失1个碱基

Note：“-” indicates that one base is missing at this site

图1 蒙古黄芪和膜荚黄芪基于ITS序列的系统发育树

2.3 黄芪饮片的检测和分析结果

基于以上研究设计，本课题组收集了16份市场上销售的黄芪饮片，通过实验设计的鉴别蒙古黄芪与膜荚黄芪的引物，结合已知的黄芪对照药材(S-mg-8、S-mg-9、S-mj-11和S-mj-12)进行扩增后电泳并测序，采用NJ法构建系统发育树，对其种类进行区分鉴定，结果见表3、图2。从构建的系统发育树可知，P-4、P-10、P-11和P-16号黄芪饮片经鉴定为膜荚黄芪，其余为蒙古黄芪，表明该方法能够应用于市场上销售的黄芪饮片基源的鉴定。

表3 黄芪饮片ITS全序列SNP位点

注：“-”表示该位点缺失1个碱基

Note：“-” indicates that one base is missing at this site

图2 基于ITS序列构建的系统发育树鉴别黄芪饮片的基源

3 讨论

分子鉴定技术是指通过直接分析遗传物质DNA的多态性来推断物种内在的遗传变异而实现药材鉴定的方法，其中DNA条形码技术近年来得到了广泛应用，该技术具有不受形态特征和生物个体发育限制，检测样本范围广，高效、准确及易于实现自动化的特点[14]。基于ITS序列构建的系统发育树不仅可以分析不同物种亲缘关系的远近，而且可以直观表现不同物种的系统发生关系。韩奇亨等[15]采集列当属药用植物进行总DNA提取、PCR扩增和测序，将得到的测序结果使用MEGA 6.0软件进行分析并构建系统发育树，结果表明ITS序列能够作为列当属植物的分子鉴别方法。刘洋洋等[16]利用ITS序列对不同来源的辽细辛进行DNA分子鉴定，从系统发育树分析结果可见，ITS序列可以对细辛原植物进行鉴别，且在近缘物种鉴定方面具有较大应用价值。在鉴定中药伪品方面，基于ITS序列构建的系统发育树方法近年来也得到越来越多的重视。李振华等[17]利用ITS2序列构建系统发育树，成功鉴别出6种假龙胆属植物，表明该技术可以作为假龙胆属植物的分子鉴定方法，具有重要的应用价值。姚能等[18]建立了基于ITS2序列的多基源药材钩藤DNA条形码鉴定技术方法，能够成功用于钩藤药材真伪鉴定，为临床准确用药提供依据。基于ITS序列构建黄芪的系统发育树并用于市售黄芪饮片的基源分析，目前尚未有相关文献报道，是值得探索的研究内容。蒙古黄芪和膜荚黄芪同属于豆科黄耆属植物，为同属间不同种的近缘关系，其遗传学上的进化距离不大。本研究采用短序列ITS序列构建系统发育树以鉴定市售黄芪饮片基源，因此，使用了NJ法构建系统发育树，并以Bootstrap作1 000次可信度分析，以增加本研究的可信度。

本研究从GenBank数据库中下载了蒙古黄芪和膜荚黄芪的ITS全序列，包含了RNA ITS1-5.8S和ITS2序列，并根据参考文献设计黄芪通用引物，首先对已明确基源的黄芪药材提取DNA进行扩增和测序，构建系统发育树进行分析。结果表明，蒙古黄芪和膜荚黄芪ITS序列同源性极高，22份黄芪样品在整个ITS全序列区域仅存在几个碱基突变类型，说明仅凭借单个SNP位点分析不易区分两种黄芪的基源，而通过分析ITS全序列进行比对并构建系统发育树，可以较为准确地达到鉴别的目的。郑司浩等[13]采用三对特异性引物鉴别蒙古黄芪方法，发现蒙古黄芪ITS序列第476位点为碱基C，而膜荚黄芪为碱基T。本研究采用一对通用引物扩增后的产物，蒙古黄芪ITS序列第128位点为碱基G，而膜荚黄芪为碱基A；并且在鉴别黄芪饮片基源的过程中，随行加入了两种黄芪对照药材，聚类分析结果证实可有效鉴别蒙古黄芪和膜荚黄芪，且市售黄芪饮片中蒙古黄芪占主要部分。

综上所述，因蒙古黄芪和膜荚黄芪同属豆科黄耆属植物，亲缘关系近，基因差别小，以往使用单基因差异很难对其进行鉴别；此外，蒙古黄芪和膜荚黄芪表型形状差异不突出，存在混杂种植和相互杂交的情况，因此，两种黄芪之间基因差异越来越小，区分的难度加大。这就要求首先构建一个充分体现黄芪属种内变异和种间分化的完整的参考序列数据库，用以进行系统进化分析和准确的物种界定。黄芪样品在整个ITS全序列区域仅存在几个碱基突变类型，仅用聚类分析进行分析鉴定，结果可信度有限，这是今后需要进一步完善的研究。