三七中人参皂苷Rg1的不同提取工艺对比

朱美旗，刘雪懿，钱文强，张立翱，杨阳

（西安医学院，陕西西安 710000）

三七（Panax notoginseng (Burk.)F.H.Chen）为五加科（Araliaceae）植物，药用部位为干燥根，是一种具有止血、祛瘀、消肿、止痛功能的传统中药。其主要有效成分为达玛脂烷系皂苷，具有扩张血管、增加冠状动脉血流量、降低血脂及胆固醇的作用，并对治疗冠心病和心绞痛有显著疗效[1]。中药生产过程中，活性成分提取步骤尤为关键，有效提取活性成分直接关系到中药生产的成本和经济效益[2]。一个好的提取工艺需要高提取效率[3]。因此，对4种不同的提取工艺进行比对，优选出最佳提取方法，为研究三七有效成分提取分离提供借鉴依据。

1 材料与方法

1.1 材料

药材为三七粉末，对照品为人参皂苷Rg1（上海源叶生物科技有限公司，B21057-20mg BZO，CAS#22427-39-0 HPLC ≥ 98%，储存条件 2～8 ℃），柠檬酸（0.1 mol/L）-磷酸氢二钠（0.2 mol/L）缓冲液，纤维素酶（28.6 U/g），香草醛-冰醋酸溶液（分析纯），高氯酸溶液（分析纯），甲醇（分析纯），无水乙醇（分析纯）。

1.2 实验仪器

KQ-500DE型数控超声波清洗器，北京海天友诚科技有限公司；7200型紫外分光光度计，北京京科瑞达科技有限公司；恒温水浴锅，济南欧莱博科学仪器有限公司。

1.3 对照品溶液制备

将97.7%对照品人参皂苷Rg1置干燥器中12 h，称取20 mg放入50 mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀[4]，即得到 0.3 908 mg/mL 对照品溶液。

1.4 人参皂苷Rg1的检测

吸取一定量的待测溶液，置于10 mL带塞试管中，放入80 ℃水浴锅，水浴挥干溶剂。再分别加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，60 ℃水浴15 min，立即放入冰水中进行冷却。冷却后加入 5.0 mL 冰醋酸，摇匀，放置 15 min[4]后于 529 nm处进行测定。

1.5 标准曲线的绘制

参考相关实验方法[4-5]，绘制标准曲线并求得回归方程为C=3.203 4A+0.088（R2=0.998 1）。

1.6 三七中人参皂苷Rg1的提取

1.6.1 酶解加超声提取法

取5 g三七粉末置于圆底烧瓶中，用40 mL蒸馏水浸泡30 min，加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调节pH至5，再加纤维素酶143 U置55 ℃水浴锅中，水浴28 min，期间适量搅拌，酶解后加入乙醇[6]，在数控超声波清洗器中进行提取[5]，过滤，将滤渣加乙醇再次进行提取，混合两次提取液。提取液经显色反应后，测量吸光度，代入标准曲线方程求浓度，根据提取液体积，计算含量。

分别考察50%乙醇体积、浓度、超声提取温度及超声提取时间4个因素对三七人参皂苷Rg1提取含量的影响。并在单因素实验基础上，选用L9（34）进行酶解加超声法正交实验，进一步优化实验结果。

1.6.2 超声提取法

称取5 g三七粉末，置于50 mL容量瓶中，用规定体积分数的乙醇浸润，然后乙醇定容，进行超声提取，在规定时间内取出容量瓶，静置备用。显色后在529 nm处测定吸光度，代入标准曲线方程求浓度，根据提取液体积，计算含量。分别考察乙醇体积分数、料液比、超声功率及超声提取时间4个因素对三七人参皂苷Rg1提取含量的影响，并在单因素实验基础上，选用L9（34）进行超声法正交实验，进一步优化实验结果。

1.6.3 乙醇回流提取法

取5 g三七粉末，加入乙醇回流提取，即得三七提取液。精密吸取三七提取液5.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容、摇匀、滤过，取续滤液作为供试品溶液。取供试液5.0 mL于蒸发皿中，挥干溶剂，进行显色反应后，在529 nm处测定吸光度，代入标准曲线方程求浓度，根据提取液体积，计算含量。

分别考察乙醇浓度、乙醇体积、回流时间及提取次数4个因素对三七人参皂苷Rg1提取含量的影响，并在单因素实验基础上，选用L9（34）进行乙醇回流提取法正交实验，进一步优化实验结果。

1.6.4 酶解加乙醇回流法

取三七粉末5 g，置烧杯中，加入40 mL蒸馏水浸泡30 min。取预处理过的三七液，置于圆底烧瓶中，加适量的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，放置2 min，将pH调至5.0，并在55℃水浴中加入适量的纤维素酶（28.6 U/g）恒温，在此期间适时搅拌,水浴2h，酶解后加入乙醇回流提取[6-7]，得到三七提取液，精密吸取2.0 mL三七提取液，置于 10.0 mL容量瓶中，甲醇（99.5%）定容。再取待测溶液5.0 mL于蒸发皿中，挥干溶剂，进行显色反应后，在529 nm处测定吸光度，代入标准曲线方程求浓度，根据提取液体积计算含量。

分别考察提取次数、提取时间、乙醇浓度及料液比4个因素对三七人参皂苷Rg1提取含量的影响，并在单因素实验基础上，选用L9（34）进行酶解加乙醇回流提取法正交实验，进一步优化实验结果。

2 结果与分析

2.1 酶解加超声提取法

2.1.1 单因素实验

如图1所示，（1）采用不同体积的60%乙醇在50 ℃条件下分别超声提取 50 min[8]，乙醇体积为 60 mL时，人参皂苷Rg1得率最高；（2）在乙醇量80 mL，超声提取时间50 min、超声温度50 ℃的条件下分别采用5种不同浓度的乙醇进行提取[9]，发现乙醇浓度在70%时，人参皂苷Rg1收率最大；（2）在乙醇量80 mL，乙醇浓度60%、超声温度50 ℃的条件下，分别在不同提取时间下提取三七人参皂苷Rg1[9]，发现当提取时间为70 min时，三七人参皂苷Rg1的收率最大；（3）在乙醇量80 mL，乙醇浓度60%、超声时间50 min的条件下，测定不同提取温度下人参皂苷Rg1的得率[10]，发现提取温度为50 ℃时，收率最高。

2.1.2 正交实验

在单因素实验基础上，选用表1中的正交实验因素设计L9（34）正交实验。表2的实验结果表明，乙醇体积对人参皂苷Rg1收率影响最大，其次是提取温度、乙醇浓度、提取时间；通过实验可得，最大收率在工艺A1B3C3D3时出现，收率为0.276%，与由k值得到最优组合结果一致。

2.1.3 验证试验

在最佳提取工艺条件下，即用40 mL 80%的乙醇在60 ℃条件下提取70 min,进行3组平行试验，求得平均收率为0.2807%。

2.2 超声提取法

2.2.1 单因素实验

如图2所示，在料液比1∶10（g/mL）、超声提取时间60 min、功率50 kHz的条件下分别用5组不同乙醇浓度进行提取，发现当乙醇浓度为70%时，三七人参皂苷Rg1收率最大；在70%乙醇、提取时间60 min、提取功率50 kHz的条件下分别用5组不同料液比进行提取，发现料液比为1∶12时三七人参皂苷Rg1收率最大；在料液比1∶10、乙醇浓度70%、提取时间60 min的条件下分别用5组不同超声功率进行提取，发现当提取功率为60 kHz时三七人参皂苷Rg1 收率最大；在超声功率50 kHz、料液比1∶10、70%乙醇的条件下分别用5组不同提取时间进行提取，发现当提取时间为60 min时，三七人参皂苷Rg1收率最高。

图1 酶解加超声提取法得率单因素实验

2.2.2 正交实验

在单因素实验基础上，选用表3中的正交实验因素设计L9（34）正交实验表（表4）进行超声提取法正交实验。实验结果表明，乙醇浓度对人参皂苷Rg1收率影响最大，其次是料液比、提取时间、超声功率；实验中最大收率在组合A1B2C2D2时出现，收率为1.548%，而最优组合为A2B2C3D2，不在实验范围内，因此需进行验证实验。

2.2.3 验证实验

在最佳提取工艺条件下，即用70%乙醇，以1∶12的料液比，在超声功率60 kHz下提取60 min，进行3组平行实验，求得平均收率为1.682%。

2.3 乙醇回流提取法

2.3.1 单因素实验

如图3所示，取5份5 g三七粉末，分别加入不同浓度的乙醇进行回流提取，发现当乙醇浓度为45%时，三七人参皂苷Rg1收率最高；取5份5 g三七粉末，分别加入不同体积的适宜浓度乙醇进行回流提取，发现当乙醇体积为50 mL时，三七人参皂苷Rg1收率最高；取 5份 5 g三七粉末，用 50 mL 45% 乙醇在不同的回流时间下进行提取，发现当回流时间为1 h时，三七人参皂苷Rg1收率最高；取5份5 g三七粉末，用50 mL 45%乙醇以不同次数进行回流提取，发现当提取次数为3次时，三七人参皂苷Rg1收率最高。

表3 超声提取法因素水平表

表4 超声提取法正交实验设计及其结果

2.3.2 正交实验

图2 超声提取法得率单因素实验

图3 乙醇回流提取法得率单因素实验

在单因素实验基础上，选用表5中的正交实验因素设计L9（34）正交实验。表6实验结果显示各因素影响的程度依次为提取时间＞提取次数＞乙醇量＞乙醇浓度，实验中最大收率在组合A1B2C2D2时出现，收率为1.570%，而最优组合为A1B2C3D2，因此需要进行验证实验。

表5 乙醇回流提取工艺因素水平

表6 乙醇回流法正交实验设计及其结果

2.3.3 验证实验

在最佳提取工艺条件下，即用45%乙醇50 mL，提取3次，每次时间为90 min，进行3组平行实验，所得平均收率为1.613%。

2.4 酶解加乙醇回流法

2.4.1 单因素实验

如图4所示，取酶解后的三七，按料液比1:8加入80%乙醇，以不同提取次数进行回流提取，每次回流2 h[7]，发现当提取次数为4次时，三七人参皂苷Rg1收率最高；取酶解后的三七，按料液比1:8加入80%乙醇以不同回流时间进行提取[8]，发现当回流时间为2 h时，三七人参皂苷Rg1收率最高；取经过酶解后的三七，以不同浓度的乙醇进行回流提取2 h[7-8]，发现当乙醇浓度为85%和95%时，三七人参皂苷Rg1收率最高；取经过酶解后的三七，以不同料液比进行回流提取2 h[7]，发现当料液比为1:12和1:14时，三七人参皂苷Rg1收率最高。

2.4.2 正交实验

在单因素实验基础上，选用表7中的正交实验因素设计L9（34）正交实验。由表8实验结果可知，各因素影响程度依次为乙醇浓度＞提取次数＞料液比＞提取时间，最大收率在工艺A2B2C3D1时出现，与由k值得到最优组合结果一致。

2.4.3 验证试验

图4 酶解加乙醇回流法得率单因素实验

表7 正交实验因素水平表

表8 酶解加乙醇回流法正交实验设计及其结果

按最优工艺参数，即使用10倍量85%乙醇，提取4次，每次回流1.5 h，重复试验3次，所得平均收率为2.505%。

3 结论

实验结果表明，四个方法的收率大小顺序为酶解加乙醇回流法＞超声提取法＞乙醇回流法＞酶解加超声提取法，即采用酶解加乙醇回流法提取三七中的人参皂苷Rg1所得收率最高。该方法中，影响收率的因素大小为乙醇浓度＞提取次数＞加醇量倍数＞提取时间，根据实验已优选出最佳的提取条件，即先在55℃水浴锅中用适量28.6 U/g的纤维素酶水解2h，再将酶解后的三七按料液比1∶10（g/mL）加入85%乙醇提取4次，每次回流1.5 h。