钼酸钠和抑制剂钨酸钠对草莓幼苗氮代谢关键酶与15N吸收利用的影响

刘利，韩真，李勃，陶吉寒

（山东省果树研究所，山东 泰安 271000）

钼（Mo）是植物正常生长发育不可或缺的一种微量元素［1，2］。Mo的化合价从0到+6价皆有［2］，在底物和辅酶因子（如铁硫簇、血红素和黄素类等）之间起电子传递的作用。植物主要从土壤中吸收+6价的钼酸根（MoO2-4）以满足正常生长发育所需［2］。钼单独存在于植物体内并不具有生物活性，而是以钼酶的形式参与到体内的氧化还原反应过程中［1，3-5］。植物中的钼酶有5种，分别是硝酸盐还原酶（nitrate reductase，NR）、黄嘌呤脱氢酶（xanthine dehydrogenase，XDH）、醛氧化酶（aldehyde oxidase，AO）、亚硫酸盐氧化酶（sulfite oxidase，SO）和线粒体氨肟还原蛋白（mitochondrial amidoxime reducing component，mARC）［6-8］。植物通过这些钼酶参与到氮、碳、嘌呤、激素和硫的代谢过程中，钼在植物的氮代谢过程中发挥着重要作用，参与到氮素固定、氮素还原和氮素同化过程中［3］。钼缺乏可能导致植物中硝酸盐积累，进而影响植物的正常生长发育。

世界上很多地方土壤中的有效Mo含量不能满足植物正常生长发育所需，对于酸性土壤这一现象尤其严重［9］。在我国有大约4 400多万公顷耕地缺Mo［10］，生长在有效Mo含量低的酸性黄棕壤上的冬小麦等作物出现了严重的缺Mo症状［11］。Mo缺乏的症状有钼酶活性降低、氮饥饿反应、茎和叶发育受阻、叶枯斑病、种子发育不良、坐果率降低等［2，9，12］。研究发现，钼可以提高水稻、小麦和烟草的硝酸还原酶活性，促进氮代谢，从而得出施钼可以提高氮素利用率［13-15］。我们前期研究发现，叶面喷施合适浓度的钼酸钠可以提高叶片和根系的硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶活性，然后用Ca（15NO3）2同位素示踪法直接证明了合适浓度的钼提高了草莓植株的15N利用率［16］。为了进一步研究钼酸钠对草莓氮代谢的影响，本试验中我们使用钼酸钠和钼的抑制剂钨酸钠研究其对幼苗生长发育和氮代谢关键酶活性以及15N吸收及利用的影响，以期为草莓生产上合理施用氮肥和钼肥提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料与设计

试验于2019年10—12月在济南市历城区董家草莓试验站日光温室内进行。草莓供试品种为‘章 姬’（Fragaria ananassa Duch.cv.‘Akihime’）。选取生长势一致的幼苗定植于栽培槽中，每个槽内定植2行，株距15 cm左右，共定植8棵，每个处理24棵。利用改良后的不含钼元素的霍格兰营养液培养，每隔2 d换一次营养液。试验所有溶液均用蒸馏水配制。待幼苗长到10～15片真叶时，选取生长一致的幼苗用蒸馏水进行饥饿处理7 d，然后进行试验处理。

试验分为3个处理：①CK（-Na2MoO4-Na2WO4），②Mo处理（+2.4 mmol·L-1+2.4 mmol·L-1Na2MoO460 mL），③W 处理（+2.4 mmol·L-1Na2MoO460 mL+2.4 mmol·L-1Na2WO460 mL）。Mo和W 处理每隔7 d喷施一次，一共喷施3次。然后分别用含Ca（15NO3）2（上海化工研究院生产，丰度为10.20%）但不含钼的全硝态氮霍格兰营养液培养。每个处理设置3个生物学重复，45 d后取样测定植株钼含量、氮代谢关键酶活性和15N的分配、吸收及利用。

1.2 测定项目与方法

1.2.1 植株钼含量 参照Wang等［17］的方法进行测定。称取草莓植株干样0.3 g于消解管中，加入5 mL优级纯浓硝酸浸泡过夜后，再加入2 mL优级纯双氧水，采用微波消解萃取仪进行消解，消解完全冷却后转移至比色管中，用超纯水定容至50 mL，放置过夜即可得样品待测液；同时采用相同消解方法制备空白对照。用NexION 300X型电感耦合等离子体质谱仪测定。

1.2.2 根系活力 采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法［18］测定。TTC可以被植物的根系还原，其还原量表示脱氢酶活性，作为根系活力的指标。

1.2.3 叶绿素含量 利用分光光度法［18］测定。取新鲜的草莓叶片，清洗干净，剪碎；称取3份0.2 g剪碎的叶片分别放入研钵中研成匀浆，研磨时加入少量石英砂和碳酸钙粉及3 mL 96%乙醇，研磨至变白，放置4 min左右过滤到25 mL棕色容量瓶中，反复冲洗干净研钵，冲洗过滤液均合并至容量瓶中，定容摇匀；以96%乙醇作空白，在波长665、649、470 nm 下测定吸光度，根据公式（Ca＝13.95D665-6.88D649，Cb＝24.96D649-7.32D665，CT＝Ca+Cb）分别计算叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总量CT的含量。

1.2.4 硝酸还原酶（NR）活性 采用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可以由产生的亚硝态氮的量表示。将草莓幼苗的根、茎和叶片清洗干净后，每个样品称取1.0 g，放在研钵里研磨，参照Pinto等［19］的方法用6 mL提取缓冲液提取，4℃、8 000×g离心5 min，将上清液转入试管中并编号，于540 nm测定吸光度，以每克鲜样每小时产生的亚硝态氮含量（μg·g-1FW·h-1）表示NR活性。

1.2.5 亚硝酸还原酶（NiR）活性 参照Rao等［20］及Ozawa和Kawahigashi［21］的方法测定。取0.5 g新鲜的草莓组织样品（地上部和地下部），剪碎放入预冷的研钵中，加入5 mL提取液充分研磨，纱布过滤，收集匀浆液离心获得上清液即粗酶液。反应混合液包含0.1 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.5）1 mL，10 mmol·L-1KNO20.05 mL，15 mg·mL-1甲基紫晶0.05 mL，粗酶液0.2 mL和50 mg·mL-1溶解在100 mmol·L-1NaHCO3的连二亚硫酸钠（Na2S2O4）。此混合液在25℃下保温半小时直至甲基紫晶的颜色消失。反应剩余的的量用下述方法测定：上述反应剩余液0.2 mL，水6.5 mL，10%（w/v）磺胺（溶于浓HCl中）1.8 mL，1%（w/v）萘乙二胺1.5 mL。摇匀后在30℃下黑暗保温30 min，然后在540 nm波长下比色。

1.2.6 谷氨酰胺合成酶（GS）活性 参照赵世杰等［18］的方法测定。

1.2.7 谷氨酸合酶（NADH-GOGAT）活性 参照Singh和Srivastava［22］的方法测定。以每分钟每毫克反应混合液于30℃减少1μmol NADH为一个酶活单位。

1.2.815N利用率 将植株分成根部和地上部，放入烘箱中于105℃杀青30 min，80℃烘干至恒重，称重，研磨粉碎后过0.25 mm筛，装袋备用。植株全氮用凯氏定氮法测定［23］，15N丰度在中国农业科学院原子能利用研究所用MAT-251质谱仪（美国菲尼根公司）测定。

15N利用率（%）＝器官15N吸收量（g）/施肥量（g）×100；

器官15N吸收量（g）＝Ndff×器官全氮量（g）；

Ndff（%）＝［植物样品中15N丰度（%）-15N自然丰度（%）］/［肥料中15N丰度（%）-15N自然丰度（%）］×100；

氮肥分配率（%）＝各器官从氮肥中吸收的氮量（g）/总吸收氮量（g）×100；

器官全氮量（g）＝器官生物量（g）×氮含量（%）。

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析，LSD法进行差异显著性检验，应用Microsoft Excel 2003绘制图表。

2 结果与分析

2.1 钼酸钠及抑制剂钨酸钠对草莓幼苗Mo浓度的影响

由图1可知，Mo处理的幼苗根部和地上部Mo浓度均最高，显著高于CK和W 处理，其中根部的Mo浓度显著高于地上部；W 处理地上部和根部的Mo浓度与CK无显著差异。

图1 钼酸钠及抑制剂钨酸钠对草莓幼苗地上、地下部钼浓度的影响

2.2 钼酸钠及抑制剂钨酸钠对草莓幼苗根系活力和叶绿素含量的影响

根系活力的高低直接影响植物对矿质元素的吸收和地上部的生长。由图2和图3可以看出，Mo处理的幼苗根系活力和叶绿素含量最高，显著高于其它处理；W 处理的幼苗根系活力和叶绿素含量低于CK，其中叶绿素含量显著低于CK。表明培养基中加入钼酸钠有利于促进草莓幼苗的生长。

2.3 钼酸钠及其抑制剂钨酸钠对草莓幼苗氮代谢关键酶活性的影响

Mo处理显著提高草莓幼苗地上部和根部NR、NiR、GS和NADH-GOGAT活性，而W 处理则降低其地上部和根部NR、NiR、GS和NADHGOGAT活性，而且根部NR、NiR 和NADHGOGAT活性的降幅达显著水平（图4—图7）。表明培养基中加入钼酸钠有利于硝态氮的同化作用，而加入抑制剂钨酸钠后，由于钨取代了钼，使得硝酸还原酶活性降低，硝态氮的同化作用受到抑制。

图2 钼酸钠及抑制剂钨酸钠对草莓幼苗根系活力的影响

图3 钼酸钠及抑制剂钨酸钠对草莓幼苗叶绿素含量的影响

图4 钼酸钠及抑制剂钨酸钠对草莓幼苗地上部（A1）和根部（A2）NR活性的影响

图5 钼酸钠及抑制剂钨酸钠对草莓幼苗地上部（B1）和根部（B2）NiR活性的影响

图6 钼酸钠及抑制剂钨酸钠对草莓幼苗地上部（C1）和根部（C2）GS活性的影响

2.4 钼酸钠及其抑制剂钨酸钠对草莓幼苗15 N利用率的影响

同位素15N-Ca（NO3）2标记表明，Mo处理的草莓幼苗15N利用率显著高于其它处理，而W 处理幼苗中15N利用率显著降低（图8）。

图7 钼酸钠及抑制剂钨酸钠对草莓幼苗地上部（D1）和根部（D2）NADH-GOGAT活性的影响

图8 钼酸钠及抑制剂钨酸钠对草莓幼苗15 N利用率的影响

3 讨论与结论

Mo是NR的活性成分，参与硝态氮还原为亚硝态氮的电子转移过程［2］；钨与Mo的性质相似，能够直接取代Moco（molybdenum cofactor）中的Mo，从而抑制NR活性，影响氮代谢过程［24］。叶面喷施钼酸钠能够提高草莓幼苗的氮同化能力，进而碳同化的能力也得到加强，发挥以氮增碳的作用，使得草莓幼苗长势较好，叶片为正常绿色。对培养基中加入抑制剂钨酸钠进行验证，发现只加钨酸钠的培养基上的幼苗株型变小，长势减弱，部分叶片表现为黄色，出现与氮素缺乏类似的症状。对植株体内的Mo浓度检测发现，施入钼酸钠幼苗的Mo浓度显著高于其它处理，这说明培养基中的钼参与到硝酸还原酶的合成过程，从而在植株的氮代谢过程中发挥作用。加入抑制剂的幼苗中Mo浓度和对照差异不大，这表明由于抑制剂的存在，培养基中加入的钼酸钠不能转运到植株体内，检测的Mo浓度基本上是植株体内初始Mo浓度。以上结果表明，缺Mo可能引起草莓幼苗根系和叶片结构发生异常，导致营养物质的合成及运输发生紊乱，从而影响草莓幼苗的氮代谢和碳代谢过程。

本试验结果表明，加入钼酸钠的幼苗NR活性最高，加入抑制剂钨酸钠的NR活性显著降低，其它氮代谢关键酶（NiR、GS和NADH-GOGAT）表现出类似的趋势。加入钼酸钠处理的幼苗15N利用率最高，而加入抑制剂的幼苗15N利用率较低。表明钼酸钠的加入使得植株体内Mo元素达到一种稳态平衡，有利于硝酸盐的吸收还原，促进氮素的同化。综上所述，叶面喷施2.4 mmol·L-1Na2MoO4有利于草莓幼苗生长，提高其氮代谢水平和15N吸收利用，而喷施抑制剂Na2WO4则会抑制其作用。