褐藻胶寡糖对D-半乳糖诱导小鼠骨质疏松的作用

王珊　冯文静　毛拥军

[摘要] 目的 探讨褐藻胶寡糖（AOS）对D-半乳糖（D-gal）诱导的衰老小鼠骨质疏松的作用及其可能的机制。

方法 将45只8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为对照组（Control组）、模型组（D-gal组）、D-gal+AOS低剂量组（D-gal+AOS-L组）、D-gal+AOS中剂量组（D-gal+AOS-M组）和D-gal+AOS高剂量组（D-gal+AOS-H组）。除Control组外，其余组小鼠颈背部注射D-gal 8周建立小鼠骨质疏松模型。D-gal+AOS-L、D-gal+AOS-M和D-gal+AOS-H组从第5周开始分别给予50、100、150 mg/（kg·d）的AOS灌胃4周，Control组和D-gal组给予蒸馏水灌胃。药物干预完成后，应用骨密度仪测量各组小鼠股骨骨密度，采用Western Blot检测小鼠股骨组织中衰老相关蛋白P16及氧化应激相关蛋白P67 phox的表达，RT-PCR检测氧化应激相关基因p47 phox和gp91 phox mRNA的表达及破骨细胞活化相关基因核因子κB受体活化因子配体（RANKL）mRNA的表达。

结果 D-gal组小鼠骨密度较Control组降低，AOS干预各组小鼠骨密度较D-gal组均增加，差异有统计学意义（F=46.853，P<0.05）。D-gal組小鼠股骨组织中P16和P67 phox蛋白表达较Control组增加，AOS干预各组P16和P67 phox蛋白表达较D-gal组降低，差异均有统计学意义（F=50.862、156.943，P<0.05）。D-gal组小鼠股骨组织中p47 phox、gp91 phox和RANKL mRNA相对表达量较Control组增加，AOS干预各组小鼠p47 phox、gp91 phox和RANKL mRNA相对表达量较D-gal组均降低，差异有统计学意义（F=17.373～112.311，P<0.05）。

结论 AOS对 D-gal诱导的小鼠骨质疏松具有保护作用，其机制可能与氧化应激和破骨细胞活化的抑制有关。

[关键词] 海藻酸;寡糖类;半乳糖;骨质疏松;衰老;氧化性应激;RANK配体

[中图分类号] R681

[文献标志码] A

[文章编号] 2096-5532（2020）03-0261-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.113

[开放科学（资源服务）标识码（OSID）]

[网络出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200610.1359.004.html;2020-06-11 11：06

EFFECT OF ALGINATE OLIGOSACCHARIDE ON D-GALACTOSE-INDUCED OSTEOPOROSIS IN MICE

WANG Shan， FENG Wenjing， MAO Yongjun

（Department of Geriatric Medicine， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）

[ABSTRACT]＼ Objective＼ To investigate the effect of alginate oligosaccharide （AOS） on D-galactose （D-gal）-induced osteoporosis in senescent mice and its possible mechanism.

Methods＼ A total of 45 male C57BL/6J mice， aged 8 weeks， were randomly divided into Control group， model group （D-gal group）， D-gal+low-dose AOS group （D-gal+AOS-L group）， D-gal+middle-dose AOS group （D-gal+AOS-M group）， and D-gal+high-dose AOS group （D-gal+AOS-H group）. All mice except those Control group were given subcutaneous injection of D-gal at the back of the neck for 8 weeks to establish a mouse model of osteoporosis. D-gal+AOS-L group， D-gal+AOS-M group， and D-gal+AOS-H group were given AOS by gavage at a dose of 50， 100， and 150 mg/（kg·d） for 4 weeks since week 5， and Control group and D-gal group were given distilled water by gavage. After drug intervention， dual-energy X-ray absorptiometry was used to measure bone mineral density （BMD） of the femur， Western Blot was used to measure the protein expression of the aging-related protein P16 and the oxidative stress-related protein P67 phox， and RT-PCR was used to measure the mRNA expression of the oxidative stress-related genes p47 phox and gp91 phox and the osteoclast activation-related gene receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand （RANKL）.

＼ Results＼ Compared with Control group， D-gal group had a significant reduction in BMD， and compared with D-gal group， the AOS intervention groups had a significant increase in BMD （F=46.853，P<0.05）. Compared with Control group， D-gal group had significant increases in the protein expression of P16 and P67 phox in femoral tissue， and compared with D-gal group， the AOS intervention groups had significant reductions in the protein expression of P16 and P67 phox （F=50.862，156.943;P<0.05）. Compared with Control group， D-gal group had significant increases in the relative mRNA expression of p47 phox， gp91 phox， and RANKL in femoral tissue， and compared with D-gal group， the AOS intervention groups had significant reductions in the relative mRNA expression of p47 phox， gp91 phox， and RANKL （F=17.373-112.311，P<0.05）.

＼ Conclusion

AOS exerts a protective effect against D-gal-induced osteoporosis in

mice， possibly by inhibiting oxidative stress and osteoclast activation.

骨质疏松具有骨微观结构退行性改变、骨量减少和骨密度降低的特点，导致骨强度降低[1]、骨脆性增加[2]及骨折风险增加[3]，引起了老龄化社会的广泛关注。氧化应激学说是衰老的重要机制之一[4]，该学说认为活性氧（ROS）的积聚超过机体的清除能力造成DNA损伤、激活氧化应激，从而导致衰老及衰老相关疾病的发生。ROS在体内积聚可激活核因子κB受体活化因子配体（RANKL）信号通路，导致骨吸收增加。RANKL信号通路被认为是促进破骨细胞活化的主要靶点，可激活多种下游信号通路[5]，从而促进骨吸收和破骨细胞分化过程。长期注射D-半乳糖（D-gal）可导致实验动物产生一系列类似于自然老化的病理变化，如认知障碍、氧化应激和骨量减少等[6]。用D-gal诱导建立亚急性衰老模型具有周期短、价格低廉、操作简便、结果稳定可靠等优点，已广泛应用于衰老机制研究和抗衰老药物筛选。褐藻胶寡糖（AOS）具有较高的生物活性，如抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗肿瘤等[7]。骨质疏松性骨折是导致老年人死亡的主要原因之一[8]，因此骨質疏松症的早期预防、诊断和治疗十分重要，开发更有效的延缓骨质疏松症的药物具有重要意义。目前大多数骨质疏松研究侧重于绝经后妇女，而缺乏对老年男性骨质疏松的研究。故本实验采用D-gal诱导建立小鼠骨质疏松模型，探讨AOS对衰老雄性小鼠骨质疏松的作用及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

健康雄性C57BL/6J小鼠45只，SPF级，8周龄，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，饲养于青岛大学医学部SPF级实验动物中心。饲养条件：12 h昼夜循环，室温（20±2）℃，相对湿度40%～60%，自由摄食物和水。动物实验操作均经青岛大学动物福利和伦理管理委员会批准，并且遵守中国动物保护委员会制订的《动物保护与使用指南》。P16小鼠单克隆抗体购自美国 Cell Signaling Technology公司，RIPA裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司，逆转录试剂盒及Mix购自Roche公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及处理 45只小鼠适应性喂养1周后，随机分为对照组（Control组，A组）、模型组（D-gal组，B组）、D-gal+AOS低剂量组（D-gal+AOS-L组，C组）、D-gal+AOS中剂量组（D-gal+AOS-M组，D组）以及D-gal+AOS高剂量组（D-gal+AOS-H组，E组），每组9只。Control组小鼠颈背部皮下注射灭菌注射用水5 mL/（kg·d），其余组小鼠颈背部皮下注射D-gal 200 mg/（kg·d），连续8周。从D-gal注射第5周开始，AOS干预低、中、高剂量组分别给予AOS 50、100、150 mg/（kg·d）灌胃处理4周，Control组和D-gal组小鼠给予蒸馏水10 mL/（kg·d）灌胃处理4周。

1.2.2 骨密度测量 药物干预完成后，取每组各3只小鼠的同侧股骨，采用双能X线骨密度仪（Dexa;Osteosys Primus，Korea）对整个股骨进行骨密度测量（扫描间距1.5 mm，扫描速度60 mm/s）。

1.2.3 Western Blot检测P16和P67 phox蛋白表达 药物干预完成后，取每组各3只小鼠的股骨组织进行液氮研磨，将RIPA裂解液加入研磨好的股骨组织中提取蛋白，用BCA试剂盒检测蛋白浓度。提取的蛋白进行SDS-PAGE电泳，待溴酚蓝至分离胶底部时转移到PVDF膜上，凝胶成像系统成像后用Quantity One软件分析灰度值。

1.2.4 RT-PCR检测股骨组织p47 phox、gp91 phox和RANKL mRNA的表达 药物干预完成后，取每组各3只小鼠的股骨组织进行液氮研磨，加Trizol 50～100 g/L，颠倒混匀室温放置30 min。4 ℃下以12 000 r/min离心5 min，弃沉淀，加1/5体积氯仿，充分震荡混匀后置于冰上静置5 min。4 ℃下以12 000 r/min离心15 min，将上清转移至新的1.5 mL EP管中。加入与上清等体积的异丙醇，充分震荡混匀，置于冰上静置10 min。4 ℃下以12 000 r/min离心10min，弃上清，加体积分数0.75的乙醇溶液悬浮沉淀。4 ℃下以12 000 r/min离心5 min，吸除上清，自然晾干后加入10 μL DEPC水溶解RNA。用Nanodrop分光光度计测定RNA浓度，用逆转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA。应用RT-PCR法进行扩增，扩增条件：95 ℃、600 s，95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共计40个循环;95 ℃、10 s，65 ℃、60 s，97 ℃、1 s。PCR引物及其序列见表1。

1.3 统计学方法

应用SPSS 21.0软件对数据进行统计学分析，

计量数据以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 各组小鼠股骨骨密度比较

与Control组相比较，D-gal组小鼠股骨骨密度明显下降;与D-gal组相比较，AOS干预各组小鼠股骨骨密度明显增加，差异均有统计学意义（F=46.853，P<0.05）。见表2。

2.2 各组小鼠股骨组织中P16和P67 phox蛋白表达比较

与Control组相比较，D-gal组小鼠股骨组织中P16和P67 phox蛋白表达增加;与D-gal组比较，AOS干预各组小鼠股骨组织中P16和P67 phox蛋白表达降低，差异均有统计学意义（F=50.862、156.943，P<0.05）。见图1、表2。

2.3 各组小鼠股骨组织中p47 phox、gp91 phox 和RANKL mRNA表达比较

与Control組相比较，D-gal组股骨组织中p47phox、gp91 phox和RANKL mRNA表达增加;与D-gal组相比，AOS干预各组小鼠股骨组织中p47 phox、gp91 phox和RANKL mRNA表达降低，差异均有统计学意义（F=17.373～112.311，P<0.05）。见表3。

3 讨论

到2050年，65岁以上的老年人口将超过8亿。随着世界人口平均寿命的延长，衰老相关疾病如阿尔茨海默病[9]、骨质疏松[10]等的发病率和死亡率将明显增加，其造成的社会医疗负担也日益加重。骨质疏松症是一种与年龄相关的退行性疾病，严重影响人们的生活质量，导致老年人的死亡率增加。衰老可以引起骨皮质和骨小梁的矿化减少、孔隙度增加及骨密度降低等，导致骨质疏松和骨折的风险增加[11]。本文研究结果显示，D-gal组衰老性骨质疏松模型小鼠的股骨骨密度较Control组显著降低，而与D-gal组相比，AOS干预各组小鼠的股骨骨密度显著增加。说明AOS对D-gal诱导的骨质疏松有保护作用。P16作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子[12]，在衰老和抑制肿瘤生长过程中起重要作用。P16在大多数啮齿动物和人体组织中的表达随年龄增长而显著增加[13]。本文结果显示，P16蛋白在D-gal组股骨中的表达增加，而与D-gal组相比，AOS干预各组小鼠股骨中P16蛋白的表达降低，说明AOS延缓了D-gal诱导的衰老进程。

氧化应激可诱导DNA损伤和细胞衰老，而抑制衰老可能是治疗骨丢失的有效方法。氧化应激与许多年龄相关疾病（骨质疏松、心血管疾病和神经退行性疾病等）有关，它可以破坏骨骼系统中骨吸收和骨形成的动态平衡，使骨硬度和强度降低，在骨质疏松的发生和发展中起重要作用[14]。ROS的一个主要来源是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶，它可促进氧化应激的发生。本研究结果显示，D-gal组股骨中NADPH氧化酶亚基p67 phox、p47

phox和gp91 phox的mRNA表达增加，而与D-gal组相比，AOS干预各组股骨中NADPH氧化酶亚基mRNA表达减少。表明AOS对衰老性骨质疏松的保护作用可能与氧化应激的抑制有关。

随着年龄的增长，破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨生成之间失去平衡[15]，当骨吸收超过骨形成时出现骨代谢失衡，引起骨量降低从而导致骨质疏松的发生。RANKL在破骨细胞生成中发挥着重要的作用[16]，可以与核因子κB受体活化因子（RANK）结合激活信号通路，促进破骨细胞活化、分化和成熟等过程[17]。RANKL相关信号通路被认为是促进骨丢失和破骨细胞活化的主要靶点[18]。本研究结果显示，在衰老性骨质疏松D-gal组股骨中RANKL mRNA表达增加，而与D-gal组相比，AOS干预各组小鼠股骨中RANKL mRNA表达降低，说明AOS对衰老性骨质疏松的保护作用可能与RANKL通路抑制有关。

综上所述，AOS对D-gal诱导的C57BL/6J小鼠骨质疏松有保护作用，其机制可能与氧化应激和破骨细胞活化抑制有关，具体机制还需进一步研究。

[参考文献]

[1]CHEN L R， HOU P， CHEN K H. Nutritional support and physical modalities for people with osteoporosis： current opi-

nion[J]. Nutrients， 2019，11（12）：2848.

[2]BOTTANI M， BANFI G， LOMBARDI G.Perspectives on miRNAs as epigenetic markers in osteoporosis and bone fracture risk： a step forward in personalized diagnosis[J].  Front Genet， 2019，10：1044.

[3]ZHANG Zhida， REN Hui， SHEN Gengyang， et al. Animal models for glucocorticoid-induced postmenopausal osteoporosis： an updated review[J].  Biomedicine & Pharmacotherapy， 2016，84：438-446.

[4]LI Y D， HONG Y F， YUSUFUAJI Y， et al. Altered expression of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and microRNA-1 and-133 in patients with age-associated atrial fibrillation[J].  Molecular Medicine Reports， 2015，12（3）：3243-3248.

[5]LIU Y X， ZUO G L， MENG X， et al. Adrenomedullin inhi-

bits osteoclast differentiation through the suppression of receptor activator of nuclear factor-κB ligand-induced nuclear factor-κB activation in glucocorticoid-induced osteoporosis[J].  Exp Ther Med， 2017，14（5）：4009-4016.

[6]GIOVOS G， YAVROPOULOU M P， YOVOS J G. The role of cellular senescence in diabetes mellitus and osteoporosis： molecular pathways and potential interventions[J].  Hormones， 2019，18（4）：339-351.

[7]FALKEBORG M， CHEONG L Z， GIANFICO C， et al. Alginate oligosaccharides： enzymatic preparation and antioxidant property evaluation[J].  Food Chemistry， 2014，164：185-194.

[8]DE MARTINIS M， FRANCESCHI C， MONTI D， et al. Inflammation markers predicting frailty and mortality in the elderly[J].  Exp Mol Pathol， 2006，80（3）：219-227.

[9]TOEPPER M. Dissociating normal aging from Alzheimers disease： a view from cognitive neuroscience[J]. J Alzheimers Dis： JAD， 2017，57（2）：331-352.

[10]FATHI KAZEROONI A， POZO J M， MCCLOSKEY E V， et al. Diffusion MRI for assessment of bone quality： a review of findings in healthy aging and osteoporosis[J].  J Magn Reson Imaging， 2020，51（4）：975-992.

[11]JIN H M， WANG Q Q， CHEN K， et al.Astilbin prevents bone loss in ovariectomized mice through the inhibition of RANKL-induced osteoclastogenesis[J].  J Cell Mol Med， 2019，23（12）：8355-8368.

[12]ZHEN Y Z， LIN Y J， LI K J， et al. Effects of Rhein lysinate on D-galactose-induced aging mice[J].  Exp Ther Med， 2016，11（1）：303-308.

[13]CHEN Linbo， YAO Hui， CHEN Xiongbin， et al. Ginsenoside Rg1 decreases oxidative stress and down-regulates Akt/mTOR signalling to attenuate cognitive impairment in mice and senescence of neural stem cells induced by D-galactose[J].  Neurochemical Research， 2018，43（2）：430-440.

[14]ZHU S W， WEI W F， LIU Z W， et al. Tanshinone-ⅡA attenuates the deleterious effects of oxidative stress in osteoporosis through the NF-κB signaling pathway[J].  Mol Med Rep， 2018，17（5）：6969-6976.

[15]KIERNAN J， DAVIES J E， STANFORD W L. Concise review： musculoskeletal stem cells to treat age-related osteoporosis[J].  STEM CELLS Transl Med， 2017，6（10）：1930-1939.

[16]OMI M， KAARTINEN V， MISHINA Y. Activin A receptor type 1-mediated BMP signaling regulates RANKL-induced osteoclastogenesis via canonical SMAD-signaling pathway[J].  J Biol Chem， 2019，294（47）：17818-17836.

[17]KWAK S C， BAEK J M， LEE C H， et al. Umbelliferone prevents lipopolysaccharide-induced bone loss and suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis by attenuating Akt-c-fos-NFATc1 signaling[J].  Int J Biol Sci， 2019，15（11）：2427-2437.

[18]KIM J S， LEE H， NIRMALA F S， et al. Dry-fermented soybean food （Cheonggukjang） ameliorates senile osteoporosis in the senescence-accelerated mouse prone 6 model[J].  Journal of Medicinal Food， 2019，22（10）：1047-1057.

（本文編辑 马伟平）

[收稿日期]2019-11-24; [修订日期]2020-05-07

[基金项目]国家自然科学基金资助项目（31571829，31-640050）;山东省自然科学基金资助项目（ZR2016HQ23）

[第一作者]王珊（1993-），女，硕士研究生。

[通信作者]毛拥军（1964-），男，博士，教授，博士生导师。

E-mail：mmc168@126.com。