POLE2对非小细胞肺癌细胞侵袭迁移能力的影响

姬路鹏，彭安萍，张毅，梁庭都

肺癌仍然是导致癌症发病率和死亡率的主要原因之一，预计2018年全球将有180万人死于肺癌［1，2］。肺癌按照组织学类型主要分为腺癌、鳞状细胞癌、大细胞肺癌和小细胞肺癌，其中约85%为非小细胞肺癌（non⁃mall cell lung cancer，NSCLC）［3］。NSCLC恶性程度高、预后差，尽管针对NSCLC的靶向治疗取得了长足的进步，但其五年生存率仍然较低［4，5］。如何进一步揭示NSCLC发生发展的关键驱动基因，明确有效的干预靶点，具有重要的意义。POLE（catalytic subunit of DNA polymerase epsilon）是由POLE基因编码的DNA聚合酶（DNA polymerase epsilon）的催化亚基。POLE能够及时识别并去除复制过程中产生的错误碱基。编码POLE核酸外切酶的基因突变将导致校正功能缺失，而这种缺失与肿瘤的发生、发展有密切关系［6］。研究发现，POLE2与多种疾病相关［7］，然而目前关于POLE2在NSCLC中的作用尚不明确。本研究拟在NSCLC细胞中过表达POLE2，检测其对NSCLC细胞侵袭转移能力的影响，并初步探讨可能的分子机制，以期为NSCLC的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与细胞转染

人NSCLC细胞系SPC⁃A1、A549细胞以及正常人支气管上皮样细胞系BEAS⁃2B细胞均采用含10%的胎牛血清（FBS）的DMEM培养基培养，所有的培养基中均添加100μg/mL的青霉素和链霉素。取对数生长期的细胞用于后续的实验。pcD⁃NA3.1⁃POLE2重组质粒由和元生物技术（上海）股份有限公司构建。转染前一天取对数生长期的细胞，均匀铺板，细胞贴壁后进行转染，转染试剂选择Lipofectamine 2000（Thermo Scientific，美国）。

1.2 Cell Counting Kit⁃8（CCK⁃8）

取对数生长期的细胞，计数后调整细胞密度为5000个细胞100μL，铺板96孔板，分别于转染后24 h、48 h、72 h、96 h向96孔板中加入10 μL CCK⁃8溶液（碧云天），细胞培养箱中继续孵育2 h后测量450 nm波长处的吸光度（OD）值。

1.3 Transwell迁移实验

取对数生长期的细胞，计数后调整细胞密度为5×104个细胞/200μL接种于Transwell小室的上室；在下室中加入600μL含有10%FBS的完全培养基作为趋化因子；置于细胞培养箱中进行培养；24～36 h后用棉签轻轻擦去上室中的细胞；4%多聚甲醛中固定10 min；然后用0.01%的结晶紫溶液（碧云天）染色10 min；随机选取3个视野在倒置显微镜下拍照并进行计数。

1.4 Transwell侵袭实验

侵袭实验开始的前一天，在Transwell小室内加入含有基质胶（BD，美国）的DMEM培养基（基质胶：DMEM培养基=1∶8）30μL于培养箱中过夜待用。取对数生长期的细胞，计数后调整细胞密度为1×105个细胞/200μL接种于Transwell小室的上室；在下室中加入600μL含有10%FBS的完全培养基作为趋化因子；置于细胞培养箱中进行培养；36～48 h后用棉签轻轻擦去上室中的细胞；4%多聚甲醛中固定10 min；然后用0.01%的结晶紫溶液（碧云天）染色10 min；随机选取3个视野在倒置显微镜下拍照并进行计数。

1.5 RNA提取和实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）

应用RNAiso Plus试剂（Takara，大连，中国）从细胞中提取RNA；然后应用PrimeScriptTMRT Mas⁃ter Mix反转录试剂盒（Takara）将RNA反转录为cDNA；再以cDNA为模板，用TB Green®Fast qPCR Mix实时荧光定量PCR试剂盒（Takara）进行qRT⁃PCR扩增反应。POLE2正向引物：5′⁃TGAGAAGC⁃AACCCTTGTCATC⁃3′，反向引物：5′⁃TCATCAACA⁃GACTGACTGCATTC⁃3′；MMP9 正向引物：5′⁃TG⁃TACCGCTATGGTTACACTCG⁃3′，反向引物：5′⁃GG⁃CAGGGACAGTTGCTTCT⁃3′；β⁃actin正向引物：5′⁃GAAATCGTGCGTGACATTAA⁃3′，反向引物：5′⁃AA⁃GGAAGGCTGGAAGAGTG⁃3′。以 2⁃ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.6 Western blot检测蛋白的表达水平

收集细胞提取总蛋白；BCA试剂盒（碧云天）测定蛋白浓度。SDS⁃PAGE凝胶电泳分离蛋白质后转膜；5%脱脂奶粉室温封闭1 h；加入相应的抗体（POLE2，Sigma⁃Aldrich，WH0005427M1；β⁃actin，Cell Signaling，#3700）4°C孵育过夜；TBST洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的II抗室温下孵育1 h；ECL发光液（碧云天）曝光，ImageJ测量条带的灰度值。

1.7 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行数据分析。数据采用均数±标准差（mean±SD）表示，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 POLE2在人NSCLC细胞中表达上调

为了检测POLE2在NSCLC中的表达水平，我们首先通过qRT⁃PCR的方法检测了NSCLC细胞系SPC⁃A1、A549细胞和人支气管上皮样细胞系BE⁃AS⁃2B细胞中POLE2的表达水平。研究发现，对比正常人支气管上皮样细胞BEAS⁃2B，人NSCLC细胞SPC⁃A1、A549的POLE2的表达水平较高（P＜0.05，见图1）。

2.2 POLE2过表达促进了NSCLC细胞A549的增值

图1 人支气管上皮样细胞系和NSCLC细胞系中POLE2的表达水平

为了探讨POLE2在NSCLC中的作用，POLE2重组过表达质粒（pcDNA3.1⁃POLE2）用于构建A549⁃POLE2过表达细胞模型，过表达效率通过qRT⁃PCR和Western blot进行验证。结果发现，与对照组（pcDNA⁃vector）相比，A549细胞的POLE2的mRNA和蛋白水平明显上调（P＜0.05，见图2）。

图2 POLE2过表达效率验证

接下来，我们通过CCK⁃8实验检测过表达POLE2对于A549细胞增值能力的影响，结果发现，过表达POLE2明显促进了A549细胞的增值（P＜0.05，见图3）。

2.3 POLE2过表达促进了A549细胞的侵袭迁移

为了探讨POLE2对于A549细胞侵袭迁移能力的影响，我们通过Transwell实验探讨A549细胞在过表达POLE2前后侵袭迁移能力的变化。Tran⁃swell迁移实验结果显示，过表达POLE2明显促进了A549细胞的侵袭迁移（P＜0.05，见图4）。

2.4 POLE2过表达上调了MMP9的表达

图3 CCK⁃8检测过表达POLE2对A549增殖能力的影响

图4 Transwell检测POLE2过表达对A549细胞的侵袭迁移能力的影响

通过qRT⁃PCR法检测过表达POLE2后A549细胞MMP9的表达情况。结果显示，相比对照组pcDNA⁃vector），转染pcDNA⁃POLE2过表达质粒，MMP9表达水平上调（P＜0.05，见图5）。

图5 qRT⁃PCR法检测POLE2过表达后A549细胞MMP9的表达水平

3 讨论

尽管针对NSCLC的治疗已经有了巨大的进步，但其五年生存率仍然较低［4，5］，主要原因是临床上确诊的NSCLC病例往往已经处于中晚期［5］。因此，急待开发新的针对NSCLC的治疗靶点。人类基因组至少有15种DNA聚合酶，共同调控基因的复制与修复［8］。其中DNA聚合酶B家族的结构和功能具有高度的保守性［8，9］，保守区域的碱基发生突变常引起DNA保真性的下降［10］。POLE2属于DNA聚合酶B家族中的成员，是由POLE基因编码的DNA聚合酶ξ的亚基。POLE是DNA聚合酶核心结构，大致分为两个部分，N端包含催化亚基中最重要的两个区：聚合酶区和核酸外切酶区，C端无催化功能，但起到与DNA聚合酶ξ另外三个亚基相互联系的作用。POLE突变与肿瘤的发生、发展密切相关。

为了研究POLE2对NSCLC细胞侵袭转移能力的影响，我们首先通过qRT⁃PCR的方法检测了NSCLC细胞系和人支气管上皮样细胞中POLE2的表达水平。结果显示，POLE2在人NSCLC细胞SPC⁃A1、A549中的表达较人支气管上皮样细胞BEAS⁃2B高，提示POLE2在NSCLC的发生发展中可能发挥重要的作用；继而，我们以POLE2表达相对较低的A549细胞为研究对象，探讨POLE2对于NSCLC细胞侵袭迁移能力的影响。本研究将重组质粒pcDNA3.1⁃POLE2转染至A549细胞中，上调A549细胞POLE2的表达，结果显示过表达POLE2能够促进A549细胞的增殖和侵袭迁移。POLE2属于DNA聚合酶超家族的一员。近年来研究发现，POLE2作为关键的癌基因，参与多种恶性肿瘤的发生发展。新进研究表明，POLE在子宫内膜癌、结直肠癌中发挥重要作用［11，12］。本研究结果显示过表达POLE2同样促进了NSCLC细胞的侵袭迁移。肿瘤的转移是一个复杂过程，与细胞内信号转导有关。基质金属蛋白酶（MMP）家族参与调控肿瘤细胞的侵袭迁移过程［13，14］。肿瘤细胞合成和分泌MMP降解细胞外基质，促进肿瘤细胞的侵袭转移［15］。MMP9是MMPs家族重要成员，与肿瘤的侵袭迁移密切相关［16］。本研究发现POLE2可能通过上调MMP9从而促进NSCLC细胞的侵袭迁移。

综上所述，本研究证实POLE2在NSCLC细胞中呈高表达，过表达POLE2可能通过上调MMP9的表达促进NSCLC细胞的侵袭迁移，这为NSCLC的进一步治疗提供了可能的靶点。