树鼩连接黏附分子A 的基因克隆及初步功能研究

李晓飞, 孙晓梅, 王文广, 匡德宣, 陆彩霞, 仝品芬, 罕园园, 李 娜, 代解杰

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心, 昆明 650118)

连接黏附分子A(junctional adhesion molecule A，JAM-A)是具细胞黏附作用的细胞免疫球蛋白超家族成员，也称之为JAM-1、JAM1 和F11R。JAM-A 在胚胎发育、正常组织结构维持、炎性反应与免疫应答、创伤修复、肿瘤转移等多种生理病理过程中发挥重要作用[1]。此外，JAM-A 还可作为病毒感染受体，是目前发现的哺乳动物呼肠孤病毒(mammalian reovirus，MRV)建立外周感染的高亲和力受体，通过依赖β1 整合素介导MRV内化病毒进入细胞[2]。JAM-A 的膜远端免疫球蛋白样D1结构域的同源二聚化是与MRV结合所必需[3]。

MRV 是一种双链RNA 病毒，经粪口途径进入胃肠道后被黏膜表面唾液酸受体(sialic acid，SA)吸附束缚，经消化系统蛋白酶作用转化成感染性亚病毒颗粒后，结合肠上皮细胞表面JAM-A受体感染肠道[4]。新生小鼠肠道微绒毛可介导MRV 快速感染，而成年小鼠微绒毛细胞不感染。MRV 行至小肠隐窝(特别是回肠)，被特化的滤泡相关上皮细胞即一种微褶皱膜样上皮细胞(membranous/microfold cell, M 细胞)摄取转吞至Peyer Patches 淋巴结，被肠相关淋巴组织捕获后穿过基底细胞和血管内皮细胞进入血液，与血细胞表面JAM-A 相互作用介导血行传播，在次级复制点穿过血管内皮细胞与组织细胞受体结合，导致外周组织器官感染。MRV经呼吸道进入宿主肺部后，经蛋白酶降解为感染性亚病毒颗粒，通过JAM-A 受体感染Ⅰ型肺泡上皮细胞，造成闭塞型支气管炎、间质性肺炎等。覆盖于支气管相关淋巴组织的M细胞将MRV摄取并转吞进入肺相关淋巴组织，然后进入血液传播[5]。

已知M R V 的分离宿主物种包括人、鸟、牛、猴、羊、猪、狒狒和蝙蝠等[6]。虽然MRV在多数情况下仅引起宿主轻微症状，但亦有许多研究[7]报道MRV 导致单一宿主或动物种群爆发呼吸道疾病、胃肠炎、胆道闭锁、脑水肿或脑脊髓炎等疾病，因此，对MRV 感染的研究和监视仍然是必要的。树鼩与人类及非人灵长类动物有较高的遗传同源性，在病毒感染和临床前药物开发研究中具有独特价值，这种新型实验动物正在成为生命科学研究的有力工具[8]。先前的研究多次从树鼩体内分离出呼肠孤病毒[9-11]，这些研究为树鼩可能是呼肠孤病毒易感宿主的观点提供了有力证据。但迄今为止，尚无有关树鼩JAM-A分子克隆和JAM-A作为树鼩感染呼肠孤病毒受体的研究报道。因此，本研究采用cDNA 末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends, RACE)技术获得树鼩JAM-A 全长编码序列，并对其序列和分子特征进行分析，在树鼩原代肺细胞水平验证了JAM-A作为呼肠孤病毒受体入侵树鼩原代肺泡细胞(primary tree shrew alveolar epithelial cells,pTAECs)的作用机制，为今后应用树鼩建立呼肠孤病毒感染模型并研究其感染机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

人工繁育的健康成年雄性树鼩1 只，3 月龄，体质量90～110 g，来源于医学生物学研究所树鼩种质资源中心[SCXK(滇)K2013-0001]。实验操作在医学生物学研究所树鼩种质资源中心进行[SYXK(滇)K2013-0001]。所有操作均符合实验动物伦理学要求(伦理审批号DWSP201803034)。

1.2 细胞和毒株

树鼩pTAECs 由1～2 日龄的新生树鼩分离培养获得。细胞感染所用病毒株为本实验室自患病树鼩粪便中分离纯化的呼肠孤病毒株MRV3/TS/2012。

1.3 试剂与仪器

TRIzol 试剂购自日本TaKaRa 公司，反转录合成第一链cDNA 试剂盒和PCR 预混液均购自立陶宛Fermentas 公司，RACE 扩增试剂盒购自美国Clontech 公司，胶原酶Ⅺ C7657、神经氨酸酶(NA)(产气荚膜梭菌)和抗JAM-A抗体(ab180821)均购自英国Abcam 公司，抗3 型呼肠孤病毒抗体9BG5 购自美国LSBio 公司，FITC 标记的羊抗鼠IgG SA00003-1 购自美国Proteintech 公司，梯度PCR仪购自日本TaKaRa公司，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪购自美国 Bio-Rad 公司，倒置荧光显微镜购自日本Nikon 公司。

1.4 方法

1.4.1 组织采集和总RNA 提取 给树鼩腹腔注射过量1%戊巴比妥钠以麻醉后实施安死术，无菌打开腹腔、胸腔和颅腔，取约100 mg 相关组织块置于无菌无酶1.5 mL 离心管中，加入1 mL TRIzol 试剂，放入DEPC 水处理过的钢珠，在高通量组织研磨仪中300 Hz 研磨3 min，获取组织匀浆。采集心脏抗凝全血200 µL。完成大脑、舌、食道、心、肺、肝、胆囊、胃、脾、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、肾、膀胱、睾丸、小脑、海马、颞叶、额叶、顶叶、枕叶和视交叉 25 个组织和血液的总 RNA 提取，洗涤后的白色RNA 沉淀用40 µL DEPC 水溶解，用NanoDrop 1000 分光光度计测定提取的RNA浓度和纯度。

1.4.2 PCR 和RACE 首先，扩增出JAM-A 基因的中间序列。参照试剂盒使用说明书配制反转录体系，反转录获得cDNA。以该cDNA 为模板，用JAM-A 中间序列特异性引物(表1)，进行PCR扩增，克隆测序获取JAM-A 的中间序列。其次，应用RACE 技术和PCR 扩增JAM-A 基因的3'端和5'端序列。按照JAM-A 中间序列设计5'端序列特异性引物(GSP)和3'端GSP(表1)。参照反转录合成第一链cDNA 试剂盒说明，分别合成5'RACE cDNA 和3'RACE cDNA。以5'RACE cDNA 为模板、5'端GSP 和自带接头引物，进行PCR 扩增。以3'RACE cDNA 为模板、3'端GSP 和自带接头引物，进行PCR 扩增。取扩增产物于1.5%琼脂糖凝胶(含0.5 µg/mL 溴化乙锭)进行电泳检测，胶回收纯化PCR 产物，克隆测序获取JAM-A 的3'端和5' 端序列。最后，将中间序列和两端序列进行拼接，获取树鼩JAM-A 的全长cDNA 序列。

表1 JAM-A 基因扩增引物Table 1 Amplification primers for the junctional adhesion molecule A (JAM-A) gene

1.4.3 qRT-PCR检测JAM-A的组织表达分布 根据JAM-A 的全长cDNA 序列，设计合成引物和探针(表2)，制备标准质粒，参照TaKaRa 一步法实时定量RT-PCR 试剂盒制备标准曲线。使用1.4.1节提取的各组织总RNA，以管家基因GAPDH作为内参基因，测定JAM-A mRNA 在树鼩26 个组织中的基因拷贝数。

表2 JAM-A 基因定量探针及引物 Table 2 The probe and primers for quantitative detection of junctional adhesion molecule A (JAM-A) gene

1.4.4 树鼩JAM-A 基因序列分析 对拼接后树鼩J AM-A 基因的c DN A 序列全长进行分析，用Unipro UGENE 软件分析其编码氨基酸。与GenBank 数据库中已有的JAM-A 基因进行比对，使用MEGA6.0 软件最大似然法构建系统发育树。

1.4.5 树鼩pTAECs培养 用清洗液[Hank's平衡盐溶液(不含Mg2+、Ca2+)，添加1%双抗，0.5 mmol/L二硫苏糖醇]清洗肺组织数次至上清液澄清。将肺剪碎成1 mm2大小的组织块，再用清洗液清洗数次至上清液澄清，静置10 min，去除清洗液。加入5 mL 0.125%胰蛋白酶，置于孵箱内37 ℃消化0.5 h，每10 min 摇晃一次。加入含5%血清的DMEM 完全培养液终止胰蛋白酶的消化，1 200 r/min 离心5 min，弃上清液，用1 mL 吸头吸取肺组织块，均匀分布于细胞培养瓶底部，倒置培养瓶，加入5 mL 培养液，置于37 ℃、5%CO2条件下倒置培养1 h。正置培养瓶，继续培养，每3 d 更换一次培养液。

1.4.6 病毒感染和抗体阻断 从培养箱中取出用12 孔板培养的80%～90%融合的pTAECs，弃培养液，用PBS 洗3 次，按如下方式进行处理：PBS 处理组，加入PBS，与细胞相互作用1 h；抗JAM-A 处理组，加入JAM-A 抗体(50 µg/mL)，与细胞相互作用1 h；NA 处理组，加入NA(50 mU/mL)，与细胞相互作用1 h；抗JAM-A 和NA 共同处理组，加入 JAM-A 抗体(50 µg/mL)与NA(50 mU/mL)，共同与细胞相互作用1 h。所有实验孔中，弃去与细胞表面分子相互作用的处理剂，加入MRV3/TS/2012 病毒液(滴度为106.5TCID50/mL)吸附液，4 ℃吸附1 h(每隔15 min，轻轻振摇1 次)，洗去病毒吸附液，37 ℃继续培养24 h。

1.4.7 病毒抗原的免疫荧光染色 感染后细胞在37 ℃下条件孵育24 h 以完成病毒的一步生长复制，立刻将单层细胞用1 mL 质量分数为4%的多聚甲醛溶液固定20 min，进行病毒抗原σ 1 的免疫荧光染色，一抗为抗3 型呼肠孤病毒抗体9BG5，二抗为FITC 标记的山羊抗鼠IgG。镜下观察间接免疫荧光，受感染的细胞质显现强烈的绿色荧光，细胞核无病毒抗原荧光。pTAECs 的每个处理孔随机选择3 个视野进行荧光图片的采集，使用Image Pro Plus 6.0图像分析软件，进行吸光度校正，读取荧光面积和A 值。

1.5 统计学方法

采用GraphPad Prism 6.0 软件进行数据统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，处理组与PBS 组间比较采用非配对 t 检验，P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基因片段扩增结果

RT-PCR 扩增出JAM-A 基因的中间序列片段如电泳图1A 所示，RACE PCR 扩增出JAM-A 基因的5'端和3'端基因片段如电泳图1B 和图1C所示。

2.2 JAM-A 基因特征

JAM-A 基因cDNA 全长2 962 bp，编码274氨基酸，其氨基酸序列与猫的JAM-A 高度相似(图2A)。系统发育树(图2B)显示，树鼩JAM-A基因序列与犬(Canis lupus familiaris)、猫(Felis catus)、牛(Bos taurus)最为相似，自然聚类在同一分支，之后与人和猕猴(Macaca mulatta)聚类为一支，最后与小鼠(Mus musculus)和褐家鼠(Rattus norvegicus)聚类为一支，而斑马鱼(Danio rerio)则在哺乳动物聚类分支以外的分支。

2.3 组织表达量分布

绘制树鼩25个组织和血液中的JAM-A相对表达量(以海马为1)柱状图(图3)。结果显示，JAM-A广泛表达于树鼩的外周组织，呼吸道和消化道中表达水平较高。

2.4 阻断JAM-A 可抑制呼肠孤病毒对pTAECs的感染

pTAECs 的病毒抗原免疫荧光染色和绿色荧光A 值统计结果(图4)显示，pTAECs 是呼肠孤病毒容纳细胞，抗JAM-A 抗体(50 µg/mL)单独作用在一定程度上抑制了呼肠孤病毒株MRV3/TS/2012的吸附感染效率(P ＜0.000 1)，NA(50 mU/mL)单独作用一定程度上抑制了MRV3/TS/2012病毒的吸附感染效率(P ＜0.000 1)；JAM-A(50 µg/mL)和NA(50 mU/mL)共同作用于pTAECs表面的JAM-A和SA 分子，可最大程度地抑制呼肠孤病毒的感染

图1 JAM-A 基因片段电泳图Figure 1 Electrophoresis bands of junctional adhesion molecule A (JAM-A) gene fragments

图2 JAM-A氨基酸序列分析及基因系统发育树(最大似然法; 步长: 1 000 times)Figure 2 Amino acid analysis and phylogenetic tree of junctional adhesion molecule A (JAM-A) gene

图3 树鼩25个组织和血液中JAM-A mRNA 的表达水平Figure 3 Expression levels of junctional adhesion molecule A (JAM-A) mRNA in 25 tissues and blood of tree shrew

图4 阻断JAM-A可抑制呼肠孤病毒株MRV3/TS/2012对树鼩原代肺泡细胞(pTAECs)的感染 Figure 4 Blocking of junctional adhesion molecule A (JAM-A) inhibits reovirus MRV3/TS/2012 infection of tree shrew pTAECs

(P ＜0.000 1)。

3 讨论

树鼩作为一种新型实验动物，已成为研究多种人类疾病如抑郁症、近视、乙型肝炎和丙型肝炎病毒感染等的良好模型[12]。本课题组多次从树鼩体内分离到呼肠孤病毒，认为树鼩可能是研究呼肠孤病毒感染机制的良好模型。已知呼肠孤病毒入侵宿主细胞的受体有SA、JAM-A 和NgR1，但该病毒的致病机制和感染嗜性仍有待深入研究。研究人员已于2013 年完成了中缅树鼩全基因组序列的注释[12]，此研究对了解树鼩的遗传基础具有重大意义。但以往发表的JAM-A 序列残缺不全。本研究首次克隆JAM-A 基因的完整序列，对其分子特征进行全面详细的解析，为今后研究JAM-A 分子及功能奠定了基础；同时采用抗细胞受体法初步验证了JAM-A作为呼肠孤病毒入侵树鼩细胞受体的功能。

呼肠孤病毒σ1 与靶细胞表面SA 结合，病毒颗粒在细胞表面横向扩散，促进与JAM-A 高亲和力结合，在低pH 微环境下依赖细胞膜上微管蛋白和Src 激酶协助内吞进入细胞[13-15]。本研究应用NA 消解表面的SA，用抗JAM-A 抗体封闭细胞表面的JAM-A，在pTAECs 水平验证了JAM-A对呼肠孤病毒感染的介导作用。单独使用抗JAM-A 抗体或NA 对细胞保护效果远低于同时阻断JAM-A 和SA，说明JAM-A 和SA 在介导呼肠孤病毒感染的功能上具有协同作用[16]。树鼩JAM-A mRNA 主要在器官组织表达，其中肺部表达量最高，胆囊和直肠次之，在血液细胞中也有表达。树鼩JAM-A 基因和氨基酸序列与猫相似性最高。值得注意的是，2015 年在猫科动物果子狸体内分离到一株Ⅲ型呼肠孤病毒[17]，鼻内感染雌性BALB/c小鼠引起致命性的呼吸系统损伤，在肺组织中具有较其他组织更高的病毒滴度。Ⅲ型呼肠孤病毒在树鼩肺部的病毒滴度可能更高，并造成对肺部的健康威胁，这是值得高度警惕的。

综上所述，本研究首次克隆并分析了JAM-A分子的基因序列全长，分析了JAM-A 的分子遗传进化关系，进一步说明了树鼩较其他实验动物有更高的遗传分类学地位。JAM-A 在树鼩体内主要组织器官的受体分布为研究呼肠孤病毒感染树鼩的靶器官亲嗜性提供了实验依据，细胞水平抗体阻断可抑制呼肠孤病毒感染，进一步验证了JAM-A 是介导呼肠孤病毒感染受体。可以看出，呼肠孤病毒对树鼩不同组织感染可依赖于不同的受体分子，体现了呼肠孤病毒的高度进化和环境适应性。这项研究为了解呼肠孤病毒和宿主之间的相互作用关系提供了基础资料。