养阴清热化瘀方对急性放射性肺炎大鼠TLR-4/NF-κB信号通路的影响*

李 超，宋 伟，彭 冰，雷 章，卢宏达，孔庆志△

1.湖北省荆门市第二人民医院肿瘤内科(荆门448000);2.华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院肿瘤科(武汉430061)

放射治疗是胸部恶性肿瘤如肺癌、乳腺癌、食管癌等的重要治疗手段之一，放射性肺炎是其治疗的常见并发症，发病率为13%～37%，严重影响肿瘤患者的疗效及生活质量[1]。近年来，“TLR4/NF-κB”信号通路已被证实和抗炎免疫机制关系密切。TLRs(Toll-like receptor,TLR)属于病原相关分子模式，目前研究较多的是该家族的TLR4,外源性刺激作为危险信号被TLRs所识别，激活核转录因子NF-κB，从而启动与炎症免疫相关的细胞因子如TNF-α、IL-6、TGF-β、IL-4等基因的表达，产生瀑布效应，也就是所谓的细胞因子级联学说[2]。前期研究显示，养阴清热化瘀方治疗放射性肺炎取得了较好地临床疗效和实验结果，且对患者血浆炎症细胞因子有一定影响[3]。本研究旨在干预放射性肺炎的模型大鼠的过程中，以TLR4、NF-κB为切入点，观察大鼠肺组织TLR4、NF-κB p65的含量及mRNA活性，探讨养阴清热化瘀方防治放射性肺炎的作用机制。

材料与方法

1 材 料

1.1 实验动物：PF级Wistar大鼠48只，雌、雄各24只，均购于湖北省实验动物研究中心，体重(180±20)g，8周龄，动物许可证号:SCXK(鄂)2015-0018，于湖北中医药大学动物实验中心SPF级动物实验室饲养。室温20 ℃～22 ℃，湿度40%～70%，明暗各12 h。

1.2 药 品：养阴清热化瘀方(YHF)：以《医门法律》清燥救肺汤为基本方，加减而成，药物组成：桑叶10 g，太子参、麦冬、黄芪、连翘、北沙参各15 g、当归20 g等。各药物均经过生药鉴定，水煎煮2次，过滤，浓缩成0.97生药/ml药液。

1.3 主要仪器和试剂：PRECISE直线加速器(瑞典ELEKA公司)、TB-718D石蜡包埋机(湖北泰维科技公司)、RM2235石蜡切片机(徕卡公司)、Western blotting电泳仪(Mini-PROTEAN Tetra Cell4-gel handcasting system)、S IX51光学显微镜(日本奥林巴斯公司)、酶标仪(Diatek公司，DR-200Bs)、实时荧光PCR仪(美国Bio-Rad公司)，TLR4、NF-κB抗体均由CST公司提供，TLR4、NF-κB引物均由武汉奥科鼎盛生物科技有限公司合成并纯化。

1.4 PCR引物：大鼠β-actin、TLR4、NF-κB p65引物经Pubmed核酸数据库BLAST检索为基因特异性引物。β-actin：上游5’- CGTTGACATCCGTAAAGACCTC-3’，下游：5’-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3’；TLR4引物：上游5’-AACATCAGAGGAAGAACAAGAAG-3’，下游：5’-AGGTCGTTGAGGTTAGAAGC-3’；NF-κB p65引物：上游5’-GAAGAAGCGAGACCTGGAG-3’，下游：5’- ATCCGGAACACAATGGCCAC-3’。

2 实验方法

2.1 造 模：48只Wistar大鼠随机分为空白对照组(NC)、模型组(MD)、养阴清热化瘀方提前干预组(YHF-EI)及养阴清热化瘀方组(YHF-ST)四组，每组12只。除NC组外，其他各组大鼠于照射前用10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后呈仰卧位，固定在自制的木板上，调整照射野(上：前肢腋窝中点连线，下：胸骨剑突水平)，照射野约2.7 cm×4.2 cm，勾画出射野范围，单次20 Gy照射右侧肺野。照射过程中大鼠无死亡，大鼠自然苏醒后于实验动物中心常规饲养。

2.2 给 药：除养阴清热化瘀方提前干预组(YHF-EI)提前1周给药外，其余各组于照射后第1天开始灌胃给药，1次/d，7次/周，直至实验结束。根据体重变化调整用药剂量，按照1 ml/100 g给药。中药组灌胃9.7 g/(kg·d)生药药液；空白对照组和模型组均于等量生理盐水。于照射后4周，将各组大鼠以10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠后，固定于木板上，腹主动脉取血，肝素钠抗凝管取血2 ml，摘取右肺中叶，称重后置于冻存管，液氮保存。

3 检测指标

3.1 肺组织病理学：在照射后4周，肺组织进行常规脱水-浸蜡-包埋-切片-HE染色，光镜下观察肺组织形态学改变。

3.2 酶联免疫吸附实验(ELISA)：按照试剂盒说明书步骤进行操作，具体步骤如下：向各孔加入100 μl标准品、样品(各两重复)于每孔中央，盖上密封条，室温下孵育过夜。取出板架，弃去各孔液体，洗板3次，加入酶标抗体，室温下孵育30 min，加入显色液后，于405 nm酶标仪读取吸光度，自动计算出TNF-α、IL-6、TGF-β的浓度。

3.3 Western-blotting方法：取肺组织样本的总蛋白，BCA法蛋白浓度测定蛋白浓度，取0.03 mg蛋白，于8%～12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，将分离后的蛋白进行转膜，转膜完成之后放入封闭液内，在室温环境下封闭1 h，洗膜后加入相应的一抗，4 ℃下孵育过夜，再洗膜过夜，加入HRP标记的二抗，37 ℃孵育1 h，采用ECL法进行显色，然后采用凝胶凸显分析系统拍照，并使用Alpha Ease FC软件分析蛋白表达量的差异。

3.4 实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)：总RNA的提取按照试剂盒说明操作，在灭活RNA酶环境下将Wistar大鼠约20 mg肺组织粉碎，用Trizol提取，检测其完整性及纯度，将RNA逆转录合成cDNA。取样品溶液5 μl，Master Mix 25 μl，上下游引物各1 μl，蒸馏水18 μl(反应总体积50 μl)。经过变性、退火、延伸后进行荧光检测，采用2-△△CT法计算各个基因相对内参的表达量。

结 果

1 大鼠一般状况 空白对照组大鼠活动反应、皮肤色泽及食量均正常，且体重增加；模型组从照射第1周开始出现食量减少、皮毛倒翻、精神萎靡、活动减少、反应渐渐迟钝及背毛渐渐枯槁无光泽；养阴清热化瘀方组及提前干预组精神、食量、活动度、毛发光泽度均明显好于模型组，模型组有1例大鼠死亡。

2 各组肺组织病理学改变 空白对照组大鼠肺组织结构清晰、肺泡壁薄、毛细血管完整，且无充血、水肿、炎症细胞浸润。模型组肺组织可见炎性细胞浸润，肺泡结构破坏及萎缩，可见肺泡间隔增宽，并出现少许梭形成纤维细胞。养阴清热化瘀方提前干预组及养阴清热化瘀方组大鼠肺组织可见毛细血管充血，间质轻度水肿及增厚，少许淋巴细胞浸润，但均较模型组减轻(图1)。

图1 各组大鼠肺组织病理图片(HE染色，×200)

3 酶联免疫吸附法检测大鼠血清中的TNF-α、IL-6、TGF-β含量 模型组TNF-α、IL-6、TGF-β含量较空白对照组显著升高(P<0.05)；养阴清热化瘀方组干预治疗后，两组的TNF-α、IL-6、TGF-β含量均较模型组下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；但养阴清热化瘀方提前干预组(YHF-EI)与养阴清热化瘀方组(YHF-ST)TNF-α、IL-6、TGF-β含量含量比较，无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清的TNF-α、IL-6、TGF-β含量比较

注：与NC组比较，★P<0.05;与MD组对比，*P<0.05

4 大鼠NF-κB p65和TLR4蛋白表达水平 模型组NF-κB p65和TLR4蛋白含量较空白对照组显著升高(P<0.05)；养阴清热化瘀方同步干预治疗后，两组的NF-κB p65和TLR4蛋白含量均下降，与模型组对比，差异具有统计学意义(P<0.05);但养阴清热化瘀方提前干预组与养阴清热化瘀方组NF-κB p65和TLR4的含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。

图2 各组肺组织TLR4、NF-κB p65蛋白表达情况

5 大鼠肺组织NF-κB p65、TLR4 mRNA的表达水平 与空白对照组比较，模型组TLR4 mRNA、NF-κB p65表达量明显升高(P<0.05)；同模型组比较，养阴清热化瘀方干预后，两组NF-κB p65、TLR4 mRNA均不同程度下降，具有统计学意义(P<0.05)；但养阴清热化瘀方提前干预组与养阴清热化瘀方组NF-kB p65、TLR4 mRNA的表达水平比较，未见显著性差异(P>0.05)。见表2。

表2 大鼠肺组织血清中NF-κB p65、TLR4 mRNA表达变化(ng/ml)

注：与NC组比较，★P<0.05;与MD组对比，*P<0.05

讨 论

放射性肺炎是胸部恶性肿瘤放射治疗最为常见的不良反应。其病理机制为放射线损伤肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞，导致血管通透性改变和肺泡换气功能损伤，形成细胞因子瀑布效应，释放。TNF-α、IL-6、TGF-β在放射性肺炎的发生和维持过程中占有非常重要的地位，动态监测可早期预测放射性肺炎的发生[4-5]。研究[3]已证实养阴清热化瘀方能够降低胸部恶性肿瘤放疗患者血浆中TNF-α、IL-6、TGF-β的表达水平，降低放射性肺炎发生率。研究表明急性放射性肺损伤大鼠肺组织TNF-α、IL-6、TGF-β表达水平显著升高，沉默或下调TNF-α、IL-6、TGF-β表达可以减轻放射性肺损伤的发生，且可以逆转照射引起的肺纤维化[6-8]。本实验研究发现模型组大鼠血清中TNF-α、IL-6、TGF-β表达水平显著高于空白对照组，提示射线会引起炎症的炎症反应综合征；养阴清热化瘀方组血清中TNF-α、IL-6、TGF-β显著低于模型组，但养阴清热化瘀方提前干预组未优于养阴清热化瘀方，提示养阴清热化瘀方能减弱急性放射性肺损伤的炎症反应。

TLR样受体4(TLR4)是Toll样受体超家族的一员，能够介导炎症反应，研究证实干扰TLR4相关信号通路可能促进DNA的修复，调节辐射诱导的炎症反应[9]。近年来，发现TLR4/NF-κB通路是与抗炎免疫机制密切相关的信号通路，TNF-α、IL-6、IL-10是由TLR4/NF-κB信号通路调控的。NF-κB作为一种重要的核转录因子，位于TLR4下游信号的枢纽位置，当细胞内TLR4被激活后，与其配体结合，能够通过髓系分化蛋白MyD88依赖性途径激活NF-κB，IκB被IκB激酶(IKKα/β等)磷酸化、泛素化，二聚体解离后 NF-κB p50/p65进入细胞核，其中p65能被检测，因此，NF-κB p65作为NF-κB 活性标志，启动相关基因转录，从而合成和释放多种炎症蛋白基因的表达。研究证实在LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型中炎症相关细胞因子的表达主要受TLR4/NF-κB信号通路激活释放[10]。已有文献显示以NF-κB激活依赖TLR4信号途径为基础，发现TLR4/NF-κB作为非小细胞肺癌RP临床血清样标志物，可以预测RP发生风险[11-12]。

研究发现清燥救肺汤能抑制肺癌细胞增殖，与降低NF-κB表达有关[13]，清燥救肺汤可通过调控TLR2/NF-κB信号通路抗肺炎的发生。养阴清热、润肺止咳验方主要通过下调TLR4上、下游信号通路蛋白的表达，降低炎症因子的表达,从而延缓甚至阻断放射性肺炎的发生发展[14]。有研究证实化瘀类方剂可减少肝纤维化肝组织中TLR4、MyD88及NF-κB基因的表达[15]，也可下调肺组织辐射损伤过程中NF-κB的表达。养阴清热化瘀方源自喻嘉言的《医门法律》清燥救肺方，结合急性放射性肺损伤病机加减而成，具有益气养阴清热活血之功。本实验研究结果与上述文献报道一致，模型组NF-κB p65和TLR4蛋白含量及mRNA水平较空白对照组显著升高，给药组肺组织中NF-κB p65和TLR4含量较模型组明显下降，TLR4和NF-κB p65mRNA活性也被显著抑制，与大鼠一般情况、病理形态血变化具有一致性，提示该方可能通过TLR4/NF-κB信号通路来抵抗放射性肺炎的发生。

综上所述，养阴清热化瘀方能够减轻放射性肺炎大鼠炎症损伤，推测这一作用是通过调控TLR4/NF-κB信号通路，从而抑制TNF-α、IL-6、TGF-β的产生，为放射性肺炎的治疗提供了新的思路。但本研究中提前1周给药，未显示更优地防治效果，考虑与样本量及干预时间有关。