多模板分子印迹聚合物磁性固相萃取-高效液相色谱法测定环境水样中四环素类抗生素

曾国龙，马晓国，樊银明

(广东工业大学 环境科学与工程学院，广东 广州 510000)

四环素类抗生素(TCs)是由放线菌产生的一类广谱抗生素，是我国现阶段使用较广的药物添加剂，可用于预防和治疗动物疾病。其中，具有代表性的四环素(TC)、土霉素(OTC)、金霉素(CTC)、强力霉素(DC)因成本低廉且具有广谱性而被广泛用作畜牧业的饲料添加剂和兽药[1]。四环素类抗生素被动物摄入吸收后，因其代谢性较差，不能在动物体内消化降解，而是以粪便和尿液的形式排出，并进入污水处理系统或水生环境且长期留存于水体中，对生态环境和人体健康造成危害[2]。因此，对环境水体中四环素类抗生素的分析检测极为重要。目前四环素类抗生素的检测方法主要有免疫分析法[3]、高效液相色谱法[4]和液相色谱-串联质谱法[5]等。但这些方法的样品前处理主要采用传统的固相萃取，其选择性差，易导致基质共萃取从而影响目标分析物的测定。因此，建立快速、高效的四环素类抗生素的分析方法具有重要意义。

磁性分子印迹聚合物(MMIP)是融合磁分离与分子印迹功能的一种新型分离材料，同时具有磁性材料的磁响应性和分子印迹聚合物(MIP)对目标物质的特定识别能力[6-9]。利用其磁响应特性，在外加磁场作用下可使之快速聚集，从而极大地提高分离效率[10-11]。目前，基于磁性分子印迹聚合物的固相萃取已广泛应用于食品检测[12]、生物分离[13]、环境监测[14-16]等领域。

本课题组曾成功地合成了具有良好性能的介孔硅磁性氧化石墨烯(MGO@MS)复合材料[15]。本文以此材料作为载体，四环素、土霉素、金霉素和强力霉素共同作为模板分子，采用表面分子印迹技术，以溶胶-凝胶法合成了四环素类抗生素多模板分子印迹磁性聚合物。将其作为吸附剂，用于四环素类抗生素的磁性固相萃取，并优化了固相萃取条件。通过进一步与高效液相色谱法相结合，建立了4种四环素类抗生素的同时选择性检测方法，评估了方法的分析性能，并成功应用于多种实际环境水样中四环素类抗生素的分析。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

LC-20A高效液相色谱仪配光电二极管阵列检测器(日本岛津公司)，Sigma HD 场发射扫描电子显微镜(SEM,德国蔡司公司)，傅立叶红外光谱仪(FT-IR,美国赛默飞公司)，SQUID VSM 磁强计( 美国量子设计公司)。四环素类抗生素(四环素、土霉素、金霉素、强力霉素)标准品、甲烯土霉素(MTC)标准品、N-[3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基]乙二胺(KH-792，纯度95%)、苯胺基甲基三乙氧基硅烷(KH-42，纯度95%)，均购自上海阿拉丁试剂有限公司；正硅酸乙酯、无水乙醇、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、氨水(30%)、硝酸铵均为分析纯，购自广州化学试剂厂；实验用水均为超纯水。

1.2 样品采集

环境水样采自广州市番禺区广州大学城附近河流、池塘和大学城中心湖，水样分析前过0.22 μm滤膜以去除悬浮颗粒物。

1.3 标准溶液的配制

分别准确称取0.01 g四环素、土霉素、金霉素和强力霉素标准品，加入适量水充分溶解后，转移至100 mL棕色容量瓶中，用水定容配制成100 mg/L的标准储备液，保存于2 ℃的冰箱中，1周内使用。临用前用水配制成适当质量浓度的混合标准工作液，现用现配。

1.4 介孔硅磁性氧化石墨烯的制备

按本课题组发表的文献[15]制备介孔硅磁性氧化石墨烯。将0.5 g磁性氧化石墨烯分散于100 mL水和250 mL无水乙醇的混合溶液中，加入1.5 g CTAB和5 mL氨水(30%)，超声1 h。机械搅拌下逐滴加入4 mL正硅酸乙酯(TEOS)，室温下反应24 h。外加磁场收集材料，用1%硝酸铵乙醇溶液于60 ℃下冷凝回流24 h，去除CTAB。磁分离收集材料，用无水乙醇洗涤后，于60 ℃下真空干燥12 h，得到介孔硅磁性氧化石墨烯(MGO@MS)。

1.5 分子印迹聚合物的制备

分别称取0.01 mmol土霉素、四环素、金霉素和强力霉素混合分散于50 mL无水乙醇中，磁力搅拌使其分散均匀。滴加5 mL水，充分混合后，缓慢逐滴加入KH-792(1.4 mL)和KH-42(0.6 mL)。匀速搅拌4 h后，加入介孔硅磁性氧化石墨烯(0.4 g),磁力搅拌反应24 h后，在外加磁场作用下分离得到反应产物。用甲醇-乙酸(9∶1，体积比)混合溶液对反应产物进行洗涤，去除模板分子。待洗至洗脱液中无模板分子检出后，用甲醇洗去残留的乙酸，再真空干燥,得到分子印迹聚合物复合材料(MGO@MS@MIP)。非印迹聚合物(MGO@MS@NIP)的合成除不加模板分子外，其他步骤均与印迹聚合物相同。

1.6 选择性吸附实验

将20 mg MGO@MS@MIP或MGO@MS@NIP加至20 mL 50 mg/L的甲烯土霉素、土霉素、四环素、金霉素和强力霉素混合溶液中，室温下振荡1 h。磁分离，取上清液过0.22 μm滤膜后用HPLC测定溶液中剩余的抗生素含量。

1.7 磁固相萃取实验

称取50 mg MGO@MS@MIP置于圆底烧瓶中，加入75 mL试液，振荡吸附45 min后，在外加磁场的作用下收集吸附剂，并用1 mL甲醇-醋酸(9∶1,体积比)混合溶液洗脱30 min后，磁分离，取上清液过0.22 μm滤膜，进行HPLC测定。

1.8 HPLC测定条件

Inert Sustain C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为35 ℃，流动相由甲醇-乙腈-0.01 mol/L草酸水溶液(1∶2∶7，体积比)组成，流速为1 mL/min，PDA检测波长为355 nm，进样量为10 μL。

2 结果与讨论

2.1 印迹聚合物的表征

采用SEM考察了MGO@MS和MGO@MS@MIP材料的表面形态(见图1)。可观察到，MGO@MS具有几乎规则的球体形状和光滑表面(图1A)，而相比于MGO@MS，MGO@MS@MIP的粒径明显增加(图1B)，表明分子印迹聚合物已成功修饰至MGO@MS表面。

图1 MGO@MS(A)和MGO@MS@MIP(B)的扫描电镜图；MGO@MS、MGO@MS@MIP和MGO@MS@MIP的红外光谱图(C)；MGO@MS和MGO@MS@MIP的磁滞回线图(D)Fig.1 SEM images of MGO@MS(A) and MGO@MS@MIP(B);FT-IR spectra of MGO@MS,MGO@MS@MIP and MGO@MS@NIP(C);hysteresis loops of MGO@MS and MGO@MS@MIP(D)

FT-IR常用于材料中官能团的分析。图1C为MGO@MS、MGO@MS @MIP及MGO@MS@NIP的红外光谱图。3条曲线均在490 cm-1处存在Fe-O吸收峰，这是由载体MGO@MS中的磁性Fe3O4颗粒所产生[17]，在1 098 cm-1处较强的吸收峰为材料中Si-O-Si的拉伸振动[18]。在MIP和NIP曲线约3 440 cm-1处观察到的吸收峰为功能单体的N-H弯曲振动[19]。对MIP和NIP曲线进行比较，发现两者具有相似的振动吸收峰，表明MIP和NIP具有相似的官能团和结构，这也说明模板分子在印迹材料合成过程中已被完全去除。以上结果表明印迹材料已成功制备。

MGO@MS和MGO@MS@MIP的磁滞曲线如图1D所示。结果显示，MGO@MS的饱和磁化强度可达18.12 emu/g。在其表面修饰分子印迹聚合物后，所得产物(MGO@MS@MIP)的饱和磁化强度降至7.05 emu/g。但仍表现出良好的超顺磁性，可进行快速的固液分离。

图2 MGO@MS@MIP和MGO@MS@NIP对四环素类抗生素的吸附选择性对比Fig 2 Comparison of adsorption selectivity of MGO@MS@MIP and MGO@MS@NIP for tetracycline antibiotics

2.2 MGO@MS@MIP的吸附选择性

利用结构类似物甲烯土霉素评价MGO@MS@MIP对OTC、TC、CTC和DC(MTC)4种待测物的特异性吸附能力，结果如图2所示。MIP对MTC、OTC、TC、CTC和DC的吸附量分别为0.27、3.18、2.38、13.12和1.86 mg/g，NIP对上述5种化合物的吸附量分别为0.22、0.45、0.34、1.28和0.30 mg/g。可见，MIP和NIP对4种待测物的吸附量相差较大，对MTC的吸附量则相差不大且远低于MIP对4种待测物的吸附量。上述研究表明，MGO@MS@MIP对4种待测物具有良好的吸附选择性。

2.3 磁固相萃取(MSPE)条件的优化

将制备的四环素类抗生素多模板磁性分子印迹聚合物(MGO@MS@MIP)作为吸附剂，用于四环素类抗生素的磁性固相萃取。为获得最佳的MSPE效果，优化了样品pH值、样品体积、萃取和洗脱时间以及洗脱液体积等参数。

2.3.1 样品pH值的优化在吸附剂用量为50 mg，样品体积为100 mL，萃取时间为2 h，洗脱时间为1 h条件下，通过调整溶液pH值，测试了不同pH值(pH 4.0～8.0)对TCs提取回收率的影响。如图3A所示，在pH 4.0～7.0时，4种TCs的回收率随pH值的增大而增大，且在pH 7.0时回收率最高。这可能是由于低pH值时，吸附剂表面的氨基基团易被质子化，而吸附剂主要通过氨基的氢键作用吸附目标化合物，故回收率较低。随着pH值的升高，氨基去质子化，形成更多的氢键参与萃取，因此回收率提高。但继续增大pH值时，由于氢氧根离子的不断增加，削弱了吸附剂和目标物之间的氢键作用，导致回收率降低。因此，实验确定固相萃取实验在中性条件下进行。

2.3.2 样品体积的优化吸附剂用量保持不变(50 mg)，考察不同样品体积(50、75、100、150、200 mL)对TCs提取回收率的影响。图3B显示TCs的总体回收率趋势随溶液体积的增加而降低，这与吸附剂在样品溶液中的浓度有关，样品体积较小时，吸附剂浓度高，因而吸附效率提高。考虑到较大体积的水样可提高方法的灵敏度，且在样品体积为75 mL时，回收率仍高于90%。因此，实验设定样品体积为75 mL。

2.3.3 萃取时间的优化试验了不同萃取时间(5～90 min)对提取效率的影响(见图3C)。结果显示，从5 min到15 min期间，4种TCs的回收率快速增加。这是因为在吸附初始阶段，吸附剂表面存在大量吸附位点，且样品溶液中目标物浓度较高，故目标物能快速占据吸附剂表面的吸附位点，使得吸附量迅速增大。此后回收率的增加速度变缓，直到45 min时，TCs的回收率增至90%以上，继续延长萃取时间，则回收率几乎不变，说明此时已达到吸附平衡。因此，实验选择最佳固相萃取时间为45 min。

2.3.4 洗脱液体积的优化以甲醇-醋酸(9∶1)作为洗脱液，从吸附剂中解吸OTC、TC、CTC和DC，并考察了不同洗脱液体积(1～5 mL)对TCs回收率的影响。结果显示，洗脱液体积在此范围内对回收率几乎无影响。考虑到在保证洗脱效果的基础上，应尽可能减少洗脱液的用量，避免对待测物的稀释。因此，实验确定最佳洗脱液体积为1 mL。

2.3.5 洗脱时间的优化考察了洗脱时间(5～60 min)对回收率的影响(见图3D)。结果显示，在5～30 min范围内，OTC、TC、CTC和DC的回收率随洗脱时间的增加而增加，且在30 min时回收率均大于90%。此后，继续延长洗脱时间，4种TCs的回收率几乎不变。这说明洗脱时间对回收率有较大影响，洗脱时间较短时，目标物不能完全洗脱，导致回收率较低。而经过30 min洗脱后，吸附剂上的TCs基本被洗脱干净，回收率接近100%。所以，洗脱时间设定为30 min。

图3 影响MSPE萃取TCs效果的因素Fig.3 Factors affecting extraction efficiency of TCs by MSPEA:pH value(4.0～8.0);B:solution volume(50～200 mL);C:extraction time(5～90 min);D:elution time(5～60 min)

2.4 方法性能

在优化条件下，将标准储备液逐级稀释，得到质量浓度分别为0.5、1、2、5、10、15、20、30、50 μg/L的OTC、TC、CTC和DC系列混合工作溶液，对其进行磁性固相萃取和HPLC测定。发现4种TCs在5～50 μg/L范围内呈良好线性，线性系数(r2)最高达0.998 2(见表1)。以3倍信噪比(S/N=3)对应的质量浓度为检出限(LOD)，S/N=10时对应的质量浓度为定量下限(LOQ)，得到4种TCs的LOD为0.67～0.95 μg/L，LOQ为2.13～3.50 μg/L。使用这4种TCs的混合标准溶液(50 μg/L)进行平行实验(n=6)，以测试精密度，得到4种TCs的相对标准偏差(RSD)为2.3%～5.5%。表明所建立的方法具有较好的灵敏度及精密度。

表1 4种TCs的MSPE-HPLC分析方法参数Table 1 Analytical parameters of MSPE-HPLC method for four TCs

2.5 实际样品分析

按照“1.7”对3种环境水样进行分离检测，分析结果见表2。为验证方法的可靠性，同时对4种TCs进行加标回收实验。可以看出，CTC仅在湖水样品中检出，质量浓度为2.79 μg/L。OTC、TC和DC则被普遍检出，其在河水样品中的质量浓度分别为6.83、9.36、3.64 μg/L，在池塘水样品中分别为1.68、1.16、1.58 μg/L，在湖水样品中分别为8.86、9.36、3.13 μg/L。 4种TCs的回收率为82.7%～103%，RSD为1.0%～8.8%。 研究表明，所建立的分析方法可用于实际水样中4种痕量TCs的检测。图4为湖水水样经磁性固相萃取后获得的高效液相色谱图。

表2 环境水样中OTC、TC、CTC和DC的分析结果Table 2 Analytical results of OTC,TC,CTC and DC in environmental water samples

*:not detected or no recovery

图4 湖水水样经MSPE后的高效液相色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of lake water sample after MSPEpeaks：1.OTC,2.TC,3.CTC,4.DC

2.6 与其它方法的对比

将本文建立的四环素分析方法与其他文献方法进行比较(如表3)。可以看出，相比于其它方法，本方法的检出限较低，回收率较高，精密度较好。因此，本文合成的MGO@MS@MIP可以高效地对水溶液中的4种TCs进行选择性分离富集，所建立的分析方法具有良好的实用性。

3 结 论

本文制备、表征了TCs多模板分子印迹聚合物，以其作为吸附剂用于TCs的磁性固相萃取，并通过与高效液相色谱法相结合，建立了检测4种TCs的新方法。本方法具有选择性高、分离速度快、检出限低、准确精密等优点，已成功用于环境水样中4种TCs的分析。

表3 与其他测定TCs方法的比较Table 3 Comparison with the reported methods for determination of TCs

FD:fluorescence detector,PDA:photo-diode array,DAD:diode array detector