基于G-四链体-血红素和链式放大反应的基因检测传感器的构建

孙延修，孙笑凡

(1.沈阳工学院 基础课部，辽宁 抚顺 113122；2.无锡药明生物技术股份有限公司，江苏 无锡 214122)

随着医学的发展，DNA检测在病原分析[1]、遗传病诊断[2]和法医鉴定[3]中发挥着重要的作用。截止目前，已有不同技术被用于DNA检测，如电化学[4-6]、电化学发光[7]、化学发光[8]、表面等离子体共振技术[9]等。在上述技术中，电化学DNA传感器具有高灵敏度、高选择性、简单易小型化等突出特点，因此被广泛应用于不同场景。

为了在电化学检测过程中获得足够的灵敏度，选择合适的信号放大策略显得尤为重要。常用的信号放大技术有基于纳米材料的技术和基于DNA的扩增技术。前者通常利用各种纳米材料作为信号标签的载体，高负载信号标签利用纳米材料的高比表面积提供了有效的放大检测信号[10]。然而，纳米材料的稳定性有时并不令人满意，且制备纳米材料的步骤也很繁琐。后一种技术包括聚合酶链反应、杂交链反应、链置换扩增、滚动循环扩增等，在酶催化下或无酶情况下将基于DNA杂交和扩增反应的输出信号进行扩增。聚合酶链反应需要特定酶来实现目标基因的快速合成和扩增；链置换扩增需要DNA聚合酶在引物的作用下形成新的DNA长链，以替代目标基因;滚动循环扩增以环状DNA为模板，在DNA聚合酶的催化下，延伸出大量的补体重复DNA序列。后两种扩增技术均涉及DNA聚合酶，但酶的某些反应条件限制了这类需要使用酶的DNA扩增技术的应用。而杂交链反应可在无酶情况下进行[11]，该反应以目标基因为诱发剂，通过合理的设计可以促进信号放大，提高检测灵敏度[12]。杂化连锁反应后，根据所用的标签可产生不同的读出信号，其中电化学检测因具有上述突出的特点而受到广泛关注。

G-四链体复合物是一种富含鸟嘌呤的DNA序列，在K+存在时可以折叠成空间结构，并与血红素强烈结合形成G-四链体-血红素复合物[13]。该类复合物具有标记相对容易、成本较低、抗水解和热处理稳定性好、非特异性吸附低、电化学性质典型等特点。因此，以G-四链体结构插入血红素组成的G-四链体-血红素复合物成为生物传感器中常用的信号标签[14]。

本文制备了一种简单、超灵敏的电化学DNA生物传感器，以目标基因序列为例，传感器将靶序列与辅助探针的杂交链反应耦合，形成可产生信号的G-四链体-血红素复合物。合理设计的探头触发了信号放大过程，获得了方法的高灵敏度和高特异性。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

6-巯基己醇(6-MCH，纯度为97%)、血红素(纯度≥97%)，均购自Sigma-Aldrich公司；4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸钠(HEPES，纯度≥98%，生工生物科技有限公司)；其他化学物质为分析级，实验用水均为超纯水，所有寡核苷酸均由生工生物科技有限公司合成并纯化。

用10 mmol/L PBS 缓冲液(pH 7.4，1 mol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2) 将寡核苷酸序列稀释至100 μmol/L，寡核苷酸序列如下：

捕获探针(C-DNA)：5′-HS-(CH2)6-TTTAGTACTGGTG-3′

辅助探针(A-DNA)：5′-AAATTGCTGCCTTTGGGTAGGGCGGGTTGGGCTTAGTACTGGTG-3′

目标基因：5′-GGCAGCAATTTCACCAGTACTA-3′

单碱基错配目标基因：5′-GGCAGCAATTTGACCAGTACTA-3′

三碱基错配目标基因：5′-GGCAGCAATTAGTCCAGTACTA-3′

斜体字母和下划线字母为互补序列，粗体字母为不匹配的碱基。

1.2 金电极的制备与修饰

将金电极在氧化铝粉末上打磨后，依次在水、无水乙醇、水中40 kHz超声清洗2～3 min，清洗结束后将金电极插入0.5 mol/L H2SO4溶液中循环伏安法扫描活化，扫描范围为-0.4 V～+1.5 V，扫描速度为100 mV/s，直至获得稳定的CV图。将处理后的金电极用水冲洗并用氮气吹干；将合成的C-DNA(由生工生物科技有限公司合成)用10 mmol/L PBS缓冲液溶解，-20 ℃冰箱中保藏；将C-DNA用PBS缓冲液稀释；将100 μL 0.3 μmol/L的C-DNA溶液倒扣至处理好的金电极上6 h，使得C-DNA在金电极表面形成自组装单分子层；用2 mmol/L 6-MCH封闭金电极4 h，得到修饰有C-DNA的金电极；用水淋洗电极，氮气吹干待用。

1.3 电化学DNA生物传感器的制备

将上述修饰有C-DNA的金电极浸至100 μL反应体系中，室温反应2 h；所述反应体系为：0.8 μmol/L A-DNA、一定浓度的目标基因、水及20 mmol/L PBS缓冲液。将200 μL G-四链体形成液(10 mmol/L HEPES，50 mmol/L KCl，1% 二甲亚砜，pH 8.0)倒扣至电极上，室温下放置30 min，向G-四链体形成液中加入2 μL 20 mmol/L血红素混匀，将反应液继续倒扣至电极，室温下放置1 h，水冲洗电极后，用于电化学检测。

电化学检测采用三电极系统，实验所得金电极为工作电极，Ag/AgCl为参比电极，铂丝为对电极；工作溶液为20 mmol/L HEPES缓冲液(20 mmol/L HEPES，20 mmol/L KCl，pH 8.0)，检测前先通入氮气30 min；检测方法为差分脉冲伏安法(DPV)，扫描范围-0.6～-0.15 V，振幅50 mV；取一系列不同浓度的目标基因其进行检测，得到峰电流与目标基因浓度的关系曲线。

2 结果与讨论

2.1 方法的检测原理

本文采用的信号分子为G-四链体-血红素复合物。设计了5′端连接有巯基(-SH)，且能与目标基因序列部分互补配对的C-DNA，其能与金电极通过Au-S键结合从而在金电极上进行自组装。A-DNA通过其两端的碱基与目标基因互补配对，而中间的碱基则能形成G-四链体结构。血红素加入后形成的G-四链体-血红素复合物通过其血红素卟啉铁的Fe2+、Fe3+之间的电子转移产生可检测的电化学信号，从而实现对目标基因的检测。(见图1)

图1 基于G-四链体-血红素复合物电化学检测目标基因的原理图Fig.1 Electrochemical detection principle of target DNA based on G-quadruplex-hemin complex

2.2 传感器的电化学表征

图2 不同修饰状态下金电极在缓冲液中的EIS图Fig.2 Characterization of the modification of the electrode by EISa：bare Au electrode;b：C-DNA modified Au electrode;c：6-MCH blocked capture probe modified Au electrode;d：after hybridization with the target DNA

图3 修饰C-DNA与6-MCH后金电极在不同状态下的DPV曲线Fig.3 DPV curves of C-DNA and 6-MCH modified Au electrode in different modification statusa.adding A-DNA and target DNA;b.adding target DNA and hemin;c.adding A-DNA and hermin;d.adding A-DNA,target DNA and hemin

图2分别为裸金电极、 0.5 μmol/L C-DNA修饰后的金电极、2 mmol/L 6-MCH封闭后金电极、0.5 μmol/L目标基因杂交后金电极在铁氰化钾缓冲液中的EIS检测图。结果显示，与裸金电极(曲线a)相比，C-DNA修饰后的金电极(曲线b)所产生的电阻值增加，表明C-DNA已成功固定；当修饰有C-DNA的金电极用6-MCH封闭后(曲线c)所产生的电阻值继续增加；最后添加目标基因序列之后(曲线d)，其电阻值进一步增大，表明目标序列连接成功。这也证明传感器的构建顺利，与实验原理相符合。表征结果说明所设计的传感器可用于目标基因的检测。

2.2.2 实验原理的表征为了验证所构建传感器在原理上的可行性，即A-DNA能否引至金电极表面，同时折叠成G-四链体结构，并在血红素分子存在时产生信号响应，设置了4种不同实验条件进行DPV扫描。实验结果如图3所示：未加血红素前几乎无响应电流信号(曲线a)，说明此时即使金电极表面固定有G-四链体序列，但无血红素存在时不能与金电极表面发生较明显的电子交换；当固定有C-DNA的电极与A-DNA及目标基因作用并加入血红素后(曲线d)，可观察到在-0.36 V附近产生很大的电流响应，这表明A-DNA与血红素聚合后生成了G-四链体-血红素复合物。该复合物能与金电极表面发生有效的电子转移，从而产生较大的电流响应值，表明血红素对于电化学信号的产生是必须的；未加入A-DNA(曲线b)、目标基因(曲线c)的对照组虽能产生电流响应，但该电流响应远远小于曲线d，说明无A-DNA存在而仅有血红素与C-DNA和目标基因作用、无目标基因作用而仅有血红素与C-DNA和A-DNA作用时，血红素虽能够与金电极表面发生氧化还原反应，但其产生的电流响应远远小于存在G-四链体序列时的电流响应，其作为背景信号不会较大影响该传感器对目标序列的检测和表征。这也证明该传感器的检测与实验原理相符，可用于目标基因的检测。

2.3 实验条件的优化

2.3.1 C-DNA浓度的优化A-DNA浓度和目标基因浓度均为0.5 μmol/L，以DPV法分别考察了不同浓度(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5 μmol/L)C-DNA对DNA传感器性能的影响。结果显示，随着C-DNA浓度的增加，其电流响应值也不断增大，在浓度达到0.3 μmol/L时，电流响应值趋于平缓(图4A)。因此，实验选择C-DNA的最佳浓度为0.3 μmol/L。

图4 C-DNA(A)与A-DNA(B)浓度对DPV电流响应值的影响Fig.4 Effects of C-DNA(A) and A-DNA(B) concentrations on DPV current signals

2.3.2 C-DNA修饰时间的优化取A-DNA浓度为0.8 μmol/L、目标基因浓度为0.5 μmol/L、C-DNA浓度为0.3 μmol/L，考察了不同C-DNA修饰时间(2、3、4、5、6 h)对DPV电流信号的影响。结果显示，随着C-DNA修饰时间的不断增加，传感器的电流响应值随之增大，在6 h后电流响应值趋于平衡并达到最大。这说明A-DNA连接在金电极表面上的量达到饱和时所需时间为6 h。因此，实验选择C-DNA的最佳修饰时间为6 h。

2.3.3 A-DNA浓度的优化取C-DNA浓度为0.3 μmol/L、目标基因浓度为0.5 μmol/L，考察了不同浓度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 μmol/L)A-DNA对DPV电流信号的影响。结果显示，随着A-DNA修饰浓度的不断增加，其电流响应值也随之增大，且在浓度为0.8 μmol/L时电流响应值趋于平衡并达到最大值(图4B)。因此，实验选择A-DNA的最佳浓度为0.8 μmol/L。

2.4 目标基因的检测

为了考察所构建的传感器对目标基因的检测范围和灵敏性，采用DNA传感器对不同浓度的目标基因序列进行检测。如图5A所示，随着目标基因序列浓度在0～1 000 pmol/L范围内不断增大，扫描得到的DPV电流响应值相应增加，在目标基因序列的浓度达到100 pmol/L后，其电流响应值趋于平衡，说明所构建的传感器此时已达到检测上限。由图5B可以看到，在目标基因序列浓度为0.01～10 pmol/L范围内，DPV电流响应(y，μA)与目标基因浓度(c，pmol/L)具有良好线性关系，其线性方程为：y=0.020lgc+0.189，相关系数(r2)为0.994 1，检出限(S/N=3)为8 fmol/L。

图5 目标基因在不同浓度下的DPV曲线(A)，以及检测信号与目标基因浓度的关系曲线图(B)Fig.5 DPV curves obtained in different concentration of target DNA(A) and relationship between DPV peak current and concentration of target DNA(B)concentration of target DNA(a-i):0,0.01,0.1,0.3,0.5,1.0,10,100,1 000 pmol/L;inset：linear relationship between peak current and logarithm of target DNA concentration

图6 DNA传感器对不同序列检测电流值直方图Fig.6 Histogram of the current response in the presence of different DNA

2.5 传感器对目标基因检测的特异性

为验证传感器的特异性，本文采用目标寡核苷酸序列的两种突变体进行考察。在优化实验条件下，得到所构建的传感器对目标基因(完全互补配对的目标基因序列)及其突变序列(单碱基突变的目标基因、三碱基突变的目标基因)的DPV电流响应值(见图6)。由图可看出，所构建的传感器对完全互补配对序列的电流响应最大，对单碱基突变和三碱基突变序列的电流响应值很小。上述结果表明传感器具有良好的特异性。

3 结 论

本文构建了基于链式放大反应检测目标基因的传感器，在目标基因和血红素存在下，可在电极表面引入大量信号分子，实现目标基因的灵敏检测。该方法对目标基因浓度的检测范围为0.01～10 pmol/L，检出限可达8 fmol/L。方法具有较好的选择性，实验结果令人满意。