Tim3在慢阻肺疾病患者外周血中的表达及其与疾病转归的相关性

唐新华 张辉宏 吴冬梅 李桥

慢性阻塞性肺病是一种以持续存在的气流受限为主要的常见呼吸系统疾病，多呈进行性发展[1]。慢阻肺的发展与细胞免疫功能紊乱及 T 淋巴细胞亚群比例失衡有关，辅助性 T 细胞1((T helper 1 cell, Th1)参与调控慢阻肺的炎性反应[2-3]。T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain 3, Tim3)选择性表达于活化的辅助性T细胞1(T helper 1 cell, Th1)表面，可以抑制Th1细胞介导的免疫反应[4]。研究表明Tim3与哮喘等气道高反应密切相关[5-6]。提示从外周血中探索Tim3与慢阻肺的关系成为一种思路。本研究初步探讨慢阻肺中Tim3的表达，及其与慢阻肺轻、中、重程度和转归的关系。

资料与方法

一、 研究对象

根据中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组的诊断标准[7]，选择2018年1月至2019年6月在干休所就诊的慢阻肺患者63例。排除标准：①合并有严重心脑血管疾病、免疫系统疾病活动期及使用免疫调节药物者；②合并重症肺结核、肺部肿瘤、支气管扩张、哮喘等其它呼吸系统慢性疾病者；③检查资料不全者。按临床诊断标准分级：轻度组：FEV1/FVC<70%，FEV1≥80%预计值；中度组：FEV1/FVC<70%，50%≤FEV1<80%预计值；重度组：FEV1/FVC<70%，FEV1<30%预计值或FEV1<50%预计值，伴有慢性呼吸衰竭。研究对象分为：轻度组24例，中度组19例，重度组20例。其中男34例，女29例，年龄45～79岁，平均年龄61.34±14.21岁，以同期健康体检者26例作为对照组[8]。各组间年龄、性别构成比均无统计学意义。本试验研究通过北京卫戍区海淀第二十八离职干部休养所伦理委员会批准，研究对象均签订知情同意书。

二、 标本收集

患者空腹条件下采集肝素抗凝血5mL，经抗生素为主的治疗后，结合患者症状(咳嗽、呼吸困难、喘息、发热等)和血常规、胸部影像学等检查结果再次空腹抽取肝素抗凝血5mL。对照组体检时空腹抽取肝素抗凝血5mL。

三、 PBMCs的分离及培养

将健康志愿者外周血用1640培养基1 ∶1稀释，密度梯度离心后收集单个核细胞层细胞，然后用1640培养基洗涤两次，所得沉淀物为PBMCs。TRIzol 法提取总RNA,并根据逆转录试剂盒标准步骤反转录成cDNA。实时荧光定量RT-PCR法检测Tim-3的表达：TIM3基因引物F:5′-GCAGGGCAGATAGGCATTCT-3′，R:5′-CTGCTGCTACTACTTACAAGGTC-3′; GAPDH 引物F：5′-GGAGCCAAAAGGGTCATCACTC-3′，R：5′-GAGGGGCCATCCACAGTCTTCT-3′。反应条件: 95℃ 3 分钟; 扩增反应: 95℃ 5 秒，62℃30 秒，在延伸阶段检测荧光信号，35个循环。检测结果采用2-ΔΔCt计算。实验重复3次。

四、 统计学处理

结 果

一、患者一般临床特征

63例慢阻肺患者按临床诊断标准分级分为轻度组24例，中度组19例，重度组20例，临床资料(见表1)。三组之间在年龄、性别构成、受教育程度、体重指数、吸烟指数等方面均无统计学差异(P>0.05)。

表1 不同级慢性阻塞性肺疾病患者一般临床特征分布

二、各组患者TIM3基因的表达

实时荧光定量RT-PCR法检测各组患者外周血单个核细胞中TIM3基因的表达。对照组及轻度组患者TIM3基因mRNA表达处于较低水平，中度和重度组患者TIM3表达明显增加，经ANOVA检验有显著性差异(F=5.132，P<0.05)(见表2)。63例患者经过综合治疗后，57例患者病情均明显好转。6例重度组患者治疗效果不好，未达到慢阻肺稳定期。57例治疗效果好的患者TIM3基因表达明显下降，采用配对t检验，差异有统计学意义(t=5. 795，P=0.003)(表2)。6例治疗效果不好的患者TIM3基因表达明显高于治疗效果好的患者，且治疗后TIM3基因表达无明显下降，差异没有统计学意义(t=0.879，P=0.4135)。

表2 不同级慢性阻塞性肺疾病患者外周血中单个核细胞Tim3基因表达的变化

注：*代表与对照组比较差异有显著性，△代表与治疗前比较差异有显著性。

三、TIM3基因表达水平在慢阻肺患者治疗疗效预测中的效能分析

Tim3表达预测慢阻肺患者治疗疗效的曲线下面积(AUC)为0.694 (P=0.016)，灵敏度为80%，特异度为75%，截断值(cut off)为0.324ng/mL(表3)。

表3 Tim3在慢阻肺患者治疗疗效预测中的效能分析

讨 论

Tim3是 Monney等人在寻找区分Th1和Th2的表面分子标志时发现的一个新的分子，它通过负性调节Th1细胞的功能广泛参与特异性免疫应答调节。Tim3选择性表达在活化的Th1细胞表面，可以降低IFN-γ的分泌，抑制Th1细胞介导的免疫反应并可诱导外周耐受[17-18]。近期研究发现，Tim3也在单核细胞和巨噬细胞等天然免疫细胞表面表达。与在T细胞表面的功能不同，Tim3正调节天然免疫细胞功能，诱导产生大量的促炎因子IL-1和TNF-α，通过影响这些免疫细胞的功能，参与多种炎症性疾病的发生发展过程，如移植排斥反应、慢性病毒感染等[19-20]。有文献报道Tim3在支气管哮喘的发生发展中发挥作用。支气管哮喘患者中高表达Tim3，有可能通过抑制Th1细胞的免疫应答来促进Th2细胞因子的分泌[6]。临床上可通过应用Tim3抗体促进IFN-γ等细胞因子的分泌，显著增强巨噬细胞的活化，Tim3-galectin-9信号通路可能抑制T细胞免疫，促进T细胞耐受，控制相关疾病的发生和发展。Tim3在不同细胞表达，发挥双向调节作用，充分证实Tim3在免疫调节中的关键作用[21-22]。但是目前尚无关于Tim3在慢阻肺发生发展中的作用机制相关研究。

本研究检测了轻、中、重度慢阻肺患者外周血单个核细胞中Tim3的基因表达情况，结果显示，中度及重度慢阻肺患者组Tim3高于轻度患者组及对照组，且重度患者组高于中度患者组。一方面，Tim3可能通过在巨噬细胞上的表达增强非特异性免疫反应，促进TNF-α、IL-6 等炎症介质的分泌，参与慢阻肺的发生发展进程[23]。另一方面，Th17和Th1细胞在慢阻肺患者中表达失衡，Th17细胞在慢阻肺患者中具有免疫抑制作用，可起到促进炎症反应的功能。而Tim3的表达可以调控Th17细胞的数量[24]，慢阻肺患者中高表达Tim3，有可能造成Th17细胞的数量和功能异常。治疗后，随着病情缓解，Tim3的表达也随之下调，Tim3表达预测慢阻肺患者治疗疗效的曲线下面积(AUC)为0.694 (P=0.016)，灵敏度为80%，特异度为75%，截断值(cut off)为0.324ng/mL，提示我们可以通过检测Tim3的表达来预测COPD病情变化及转归。但本研究样本量偏小，有待于以后我们扩大样本量检测，验证Tim3在慢阻肺中的诊断价值。