双酚A替代品与双酚A对非洲爪蛙急性毒性及其应激响应的比较

牛玥，朱敏，刘芃岩，秦占芬,*

1. 中国科学院生态环境研究中心，环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京 100085 2. 河北大学化学与环境科学学院，保定 071002 3. 中国科学院大学，北京 100049

双酚A(bisphenol A, BPA)是全球大量生产的化学品之一，主要用于生产聚碳酸酯塑料和环氧树脂[1]。动物和人类通过多种途径暴露于这种化学物质[2]。动物试验研究表明，BPA在生物体生殖、发育和神经功能等方面具有毒性效应[3-5]，近几年的流行病学调查数据也表明，BPA与人类某些疾病相关[6]，所以，一些国家和政府开始限制BPA的使用范围。相应地，BPA类似物开始作为BPA的替代品被投入生产和使用，如双酚F(bisphenol F, BPF)、双酚S(bisphenol S, BPS)、双酚AF(bisphenol AF, BPAF)等。BPA替代品在多种环境介质、生物样品乃至人体样品中都有检出[7-9]，因此，BPA替代品的安全性受到越来越广泛的关注。

BPA替代品与BPA的化学结构相似[10]，可能存在与BPA类似的效应，已有文献报道BPF、BPS有与BPA类似的激素活性[11]，可产生内分泌干扰效应[12]。资料显示，BPA对大鼠、小鼠和兔的经口暴露半致死剂量(LD50)分别为240、3 250和2 230 mg·kg-1[13-14]；BPF对大鼠的经口暴露LD50为4 950 mg·kg-1[13-14]。李圆圆等[15]发现，BPA和BPF对黑斑蛙蝌蚪的半致死浓度(LC50)分别为9.00和9.52 mg·L-1；任文娟等[16]报道了BPA、BPF和BPAF对斑马鱼的LC50分别为8.09、9.51和2.47 mg·L-1。当生物体暴露于化学品时，生物体为保护自身免受损伤而做出一系列的应激响应[17]，如氧化应激与热休克反应。在生物体内谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase, GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)、谷胱甘肽转移酶(glutathione transferase, GST)和硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)等是氧化应激的良好指标[18]。热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是生物体在不良环境因素作用下所产生的一组特殊的蛋白质，能维持细胞稳态应对环境变化，从而起到分子伴侣的作用。HSPs基因一般主要分为hsp90、hsp70、hsp60和小hsp共4个家族。氧化应激与热休克反应是应激响应的主要组分，是生态毒理学中用来评价化学品毒性的常用指标[18]。许多体外和动物试验表明，BPA可以诱导生物体释放活性氧产生氧化应激[18-19]。Jain等[20]研究发现，BPA暴露导致大鼠体内活性氧水平升高，产生氧化应激。还有研究表明，BPA不但能够改变秀丽隐杆线虫幼虫中GST活性，还能够改变蜗牛体内hsp70和hsp90的表达[17,21]。流行病学研究表明，人体尿液中BPA的浓度与氧化应激水平相关[22-24]。

本文选用两栖动物非洲爪蛙作为实验材料，通过研究LC50、氧化应激和热休克蛋白相关基因转录水平，比较BPA及替代品对非洲爪蛙的急性毒性以及其引起的蛙体的应激响应，从而进一步分析BPA及替代品的生态风险，同时为BPA及替代品的毒性研究提供有效数据。

1 材料与方法 (Materials and methods)

1.1 实验动物

本实验室饲养的非洲爪蛙的成年雌蛙和雄蛙，分养于盛有去氯自来水的玻璃缸中，水温(22±2) ℃，明暗光周期为12 h∶12 h。成蛙喂食1∶1配比的猪肝和商品饲料，喂食2 h后换水，每周2次。

非洲爪蛙雌蛙皮下注射300～500 IU促黄体素释放激素(LHRH)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)，雄蛙注射200～300 IU的上述激素。将雌雄蛙放于产卵容器中，置于黑暗、安静的环境中让其抱对，12 h左右即可产卵。受精卵在(22±1) ℃的去氯自来水中孵化，胚胎发育至48期的蝌蚪，进行暴露试验。

1.2 试剂与仪器

仪器和设备：高速冰冻离心机(5810/5810R，Eppendorf，德国)；PCR仪( MiniAmp，Applied Biosystem，美国)；荧光定量PCR仪(MX3500P，Strata gene，美国)；组织碾磨仪(MM301，Retsch，德国)；涡旋混匀器(VORTEX 2，WIGGENS，美国)；全自动核酸提取仪(AU1001，北京百泰克生物技术有限公司)；电子天平(JA2003B，上海越平科技仪器有限公司)；移液器(Eppendorf，德国)；全自动凝胶成像仪(GBOX-HR，Syn Gene，英国)；普通PCR仪(My Cycler TM，BIO-RAD，美国)；电泳仪(DYCP-31F，北京六一仪器厂)。

试剂：BPA(CAS No. 80-05-7，纯度97%，ACROS Organics，分子量228.29)；BPF(CAS No. 620-92-8，纯度>99%，东京化成工业，分子量200.24)；BPAF(CAS No. 1478-61-1，纯度99%，北京百灵威科技有限公司，分子量336.23)；二甲基亚砜(DMSO，CAS No. 67-68-5，纯度≥99.5%，Sigma-Aldrich，美国)；核酸染料(G-red)和RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；反转录试剂盒Fast Quant RT Kit和RT-qPCR试剂盒Super Real Pre Mix Plus(SYBR Green)kit(天根生化科技有限公司，北京)；PCR引物(华大基因，北京)。

1.3 非洲爪蛙蝌蚪急性毒性试验

BPA、BPF和BPAF用助溶剂DMSO配成100 g·L-1的储备液。设置溶剂对照组，其中溶剂的浓度与最高浓度处理组溶剂浓度相同，溶剂的体积浓度不超过0.01%。暴露实验在玻璃缸内进行，每个缸盛有1 L暴露液，蝌蚪随机放入10尾。每隔24 h换一次水，清除死亡个体，记录死亡数，实验持续48 h。

在正式实验之前先对3种化学物质进行较大浓度范围(0.1、1、10、100和1 000 mg·L-1)的预试验，不设平行组，各浓度的缸中加入10尾蝌蚪，观察记录48 h蝌蚪死亡数。根据预试验得出的结果，设置正式试验浓度。正式试验以1.2为公比设置5个浓度梯度(表1)和溶剂对照组，每组3个平行，每个缸中随机加入10尾蝌蚪。其他同预实验，重复2次正式试验。

表1 双酚A(BPA)、双酚F(BPF)和双酚AF(BPAF)的浓度设置Table 1 Concentration of bisphenol A (BPA), bisphenol F (BPF) and bisphenol AF (BPAF)

1.4 RNA提取和RT-qPCR

每个缸随机取2尾蝌蚪，全自动核酸提取仪提取RNA，超微量分光光度计测定RNA浓度，用琼脂糖凝胶电泳来确定RNA完整性。然后根据Fast Quant RT Kit(with g DNase)说明书配制20 μL反应体系进行反转录。

根据SYBR Green PCR Kit说明，配制10 μL反应体系进行RT-qPCR。PCR程序为：95 ℃预变性15 min，40个循环扩增(95 ℃变性10 s、退火20 s、72 ℃延伸20 s)。每个基因在使用之前都进行了扩增效率的验证，计算公式为E=(10-1/slope-1)×100。扩增效率在90%～110%之间、溶解曲线单一且重合、不存在非特异性扩增的基因时，可用于后续实验。进行基因表达分析时，以rpl8为管家基因对各个基因的表达进行标准化[25]。基因的相对表达量根据公式2-ΔΔCT计算[26]。引物及相关信息如表2所示。

1.5 数据统计

用SPSS 16.0进行数据分析。统计单元为缸，即n值等于平行缸数[27]。重复2次正式试验，得到相似的结果，在文中只呈现其中一次的试验数据[28]。回归分析使用Probit，建立“剂量-效应”线性方程，并计算LC50值及其95%置信区间。统计数据均以平均值±标准误(standard error of mean, SEM)表示。暴露组与各自的对照相比，显著性差异采用单因素方差(one-way ANOVA)分析，P值<0.05认为有显著性差异。

2 结果(Results)

2.1 非洲爪蛙蝌蚪急性毒性试验

溶剂对照组中非洲爪蛙蝌蚪无死亡，试验质量控制良好。BPA、BPF和BPAF暴露组蝌蚪均有不同程度的死亡(图1)。24 h时，4.82 mg·L-1BPA、7.23 mg·L-1BPF和1.93 mg·L-1BPAF暴露组的蝌蚪存活率分别为93.33%、83.33%和100%，10.00 mg·L-1BPA暴露组蝌蚪的存活率为20%，15.00 mg·L-1BPF和4.00 mg·L-1BPAF暴露组蝌蚪的存活率相同，均为0%。48 h时，5.79 mg·L-1的BPA暴露组中蝌蚪的存活率由24 h的76.67%下降到73.33%，12.50 mg·L-1的BPF暴露组的蝌蚪存活率与24 h时相比下降了16.67%，其他浓度暴露组的蝌蚪存活率不变。观察蝌蚪死亡现象时发现，15.00 mg·L-1BPF暴露组实验开始不久，蝌蚪沉到水底，很快死亡，其他浓度BPF暴露组的部分蝌蚪也出现了上述现象，并清楚看到存活蝌蚪的腮充血，在显微镜下观察发现，存活蝌蚪心脏的血液回流缓慢甚至堵塞。暴露于4.00 mg·L-1BPAF的蝌蚪，先是快速没有规律地游动，同时皮肤迅速发白，很快死亡，这种现象随暴露组浓度的降低而消失。10.00 mg·L-1BPA暴露组的蝌蚪，行动迟缓，最终死亡，其他浓度BPA暴露组的部分蝌蚪也出现该现象，暴露组浓度越低该现象越不明显。

经统计分析得到BPA、BPF和BPAF对蝌蚪的24 h-LC50分别为7.59、11.58和2.87 mg·L-1；48 h-LC50分别为7.54、11.01和2.87 mg·L-1(表3)。毒性强弱顺序为BPAF>BPA>BPF。

图1 BPA、BPF和BPAF暴露后非洲爪蛙蝌蚪的存活率Fig. 1 Survival rates of Xenopus laevis tadpoles after exposure to BPA, BPF and BPAF

表2 RT-qPCR引物及相关信息Table 2 Primers sequences and relevant information for RT-qPCR

表3 BPA、BPF和BPAF对非洲爪蛙蝌蚪的LC50及其95%置信区间和回归方程Table 3 LC50, 95% confidence interval and regression equations of BPA, BPF and BPAF to Xenopus laevis tadpoles

注：LC50及其95%置信区间的单位为mg·L-1。

Note: The unit of LC50and its 95% confidence interval is mg·L-1.

2.2 BPA及替代品对非洲爪蛙蝌蚪体内氧化应激相关基因转录水平的影响

RT-qPCR结果表明(图2)，暴露48 h后，4.82～10.00 mg·L-1的BPA和7.23～12.50 mg·L-1的BPF显著上调蝌蚪体内gr、gst和trx这3种基因的转录水平，呈线性剂量-效应关系。8.68 mg·L-1BPF暴露组蝌蚪体内gst的相对表达量远高于8.33 mg·L-1BPA暴露组。8.68 mg·L-1BPF暴露组蝌蚪体内gr和trx的表达量与8.33 mg·L-1BPA暴露组类似。4.82～10.00 mg·L-1的BPA显著下调蝌蚪体内gpx的转录水平，7.23～8.68 mg·L-1的BPF与4.82～10.00 mg·L-1的BPA类似，但12.50 mg·L-1的BPF显著上调gpx的转录水平，呈现高浓度促进低浓度抑制的趋势。BPAF暴露组蝌蚪体内gst和gr基因的相对表达量与BPAF暴露浓度呈“倒U型”关系，浓度分别为2.78和2.31 mg·L-1时，gst和gr的相对表达量最高。2.31～3.33 mg·L-1的BPAF显著上调蝌蚪体内trx和gpx的转录水平，呈线性剂量-效应关系。

2.3 BPA及替代品对非洲爪蛙蝌蚪体内热休克蛋白转录水平的影响

RT-qPCR结果表明(图3)，暴露48 h后，4.82～8.33 mg·L-1的BPA显著下调蝌蚪体内hsp27和hsp90的转录水平，4.82～10.00 mg·L-1的BPA对蝌蚪体内hsp70的转录水平没有显著影响。与BPA不同，7.23～12.50 mg·L-1的BPF对蝌蚪体内hsp27、hsp70和hsp90的表达均没有显著影响，但15.00 mg·L-1的BPF显著抑制hsp27和hsp90的表达水平。2.31～3.33 mg·L-1的BPAF显著上调蝌蚪体内hsp70和hsp90的转录水平，呈线性剂量-效应关系，但对蝌蚪体内hsp27基因没有显著影响。

3 讨论(Discussion)

检测结果表明，BPA及替代品对非洲爪蛙蝌蚪的48 h-LC50排序为：BPF(11.01 mg·L-1)>BPA(7.54 mg·L-1)>BPAF(2.87 mg·L-1)。根据危险化学品分类准则[29]，BPA和BPAF对非洲爪蛙的毒性为中等毒性，BPF对非洲爪蛙的毒性略低于中等毒性标准。最近的研究表明，BPA及替代品对黑斑蛙和斑马鱼的毒性均为中等毒性[15-16]。

图2 BPA(a)、BPF(b)和BPAF(c)对非洲爪蛙蝌蚪的氧化应激相关基因转录水平的影响注：*表示P<0.05。Fig. 2 Oxidative stress related gene transcription level of Xenopus laevis tadpoles after exposure to BPA (a), BPF (b) and BPAF (c)Note: *represents P<0.05.

图3 BPA(a)、BPF(b)和BPAF(c)对非洲爪蛙蝌蚪的热休克蛋白转录水平的影响注：*表示P<0.05。Fig. 3 Transcriptional levels of heat-shock protein of Xenopus laevis tadpoles after exposure to BPA (a), BPF (b) and BPAF (c)Note: *represents P<0.05.

BPA和BPF对非洲爪蛙蝌蚪体内氧化应激相关基因gr、gst和trx转录水平的影响呈线性剂量-效应关系。对比BPF与BPA相似浓度暴露组(如8.68 mg·L-1BPF暴露组与8.33 mg·L-1BPA暴露组)蝌蚪体内gst、gr和trx的相对表达量后，发现BPF暴露组蝌蚪体内的gst基因的相对表达量高于BPA暴露组，BPF暴露组蝌蚪体内gr和trx的相对表达量与BPA暴露组类似。整体来看，BPF对蝌蚪体内氧化应激水平的影响与BPA相近。分析BPAF和BPA暴露组数据发现，2.31 mg·L-1的BPAF暴露组中蝌蚪体内gst、gr和trx基因的相对表达量与10.00 mg·L-1的BPA暴露组类似，此结果说明2.31 mg·L-1的BPAF与10.00 mg·L-1的BPA产生类似的氧化应激效应，所以BPAF对蝌蚪体内氧化应激水平的影响强于BPA。另发现，BPA及替代品对蝌蚪体内gpx基因表达水平的影响有所不同。BPA暴露组蝌蚪体内gpx表达被显著下调；12.50 mg·L-1的BPF显著上调蝌蚪体内gpx的表达水平，7.23～8.68 mg·L-1则显著下调gpx的表达水平；BPAF显著上调蝌蚪体内gpx基因的表达水平，呈线性剂量-效应关系。有研究表明，暴露于不同重金属污染物的生物体内gpx的表达水平表现为双向效应(降低或增加)，主要取决于污染物种类[20-35]。这可能为BPA及替代品对蝌蚪体内gpx转录水平的不同影响提供合理的解释。综合考虑以上结果，BPF对非洲爪蛙体内氧化应激水平的影响与BPA相近，BPAF强于BPA。

BPA及替代品对非洲爪蛙蝌蚪体内热休克蛋白表达的影响结果表明，BPA暴露组(10.00 mg·L-1除外)蝌蚪体内hsp27和hsp90的表达被显著下调。Morales等[21]研究发现，蜗牛暴露于100和500 μg·L-1BPA 48 h后，体内hsp70和hsp90基因的转录水平下降。还有研究表明，秀丽隐杆线虫暴露于250和500 μmol·L-1BPA 24 h后，体内的hsp70基因表达下调[17]。以上研究的实验物种和BPA暴露浓度与本实验不同，但BPA对生物体内热休克蛋白的影响与本研究BPA的实验结果类似。此外，BPF、BPAF对蝌蚪体内热休克蛋白的影响与BPA不一致：7.23～12.50 mg·L-1的BPF对蝌蚪体内热休克蛋白的表达水平没有显著影响，15.00 mg·L-1的BPF显著下调hsp27和hsp90的表达；BPAF对蝌蚪体内hsp27的表达没有显著影响，但BPAF显著上调蝌蚪体内hsp70和hsp90的表达，呈线性剂量-效应关系。总体来看，BPA和BPAF均影响蝌蚪体内热休克蛋白的表达水平，而BPF对蝌蚪体内热休克蛋白表达没有显著影响。

综上所述，BPA及替代品对非洲爪蛙蝌蚪的毒性强弱顺序为：BPAF>BPA>BPF；BPAF对非洲爪蛙体内氧化应激水平的影响最大，BPF与BPA相近；BPA和BPAF显著影响非洲爪蛙体内热休克蛋白表达水平，BPF没有影响显著影响。本文可为BPA及替代品的生产和使用以及相应的环境管理提供毒理学参考数据。