肺炎克雷伯菌在某院医院内感染中的分布及耐药性分析

肖启国，汤美华

湖南省衡阳市中心医院检验科，湖南衡阳 421001

肺炎克雷伯菌作为一种常见的病原体类型，广泛分布于人体皮肤、鼻咽部、呼吸道、肠道及自然界的水土中[1]。肺炎克雷伯菌常定植于人体呼吸道与肠道，可通过侵入性操作侵犯伤口和泌尿道而引起感染，当人体免疫力降低时，可以引起较为严重的感染，甚至败血症[2-4]。近年来，由于各类广谱抗菌药物大量应用于临床，同时激素、免疫抑制剂的使用也在不断增多，特别是第三代头孢菌素的广泛使用，使细菌在药物的选择压力下获得多重耐药性等，且随着产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株的出现，细菌耐药性日趋严峻[5]。对于ESBLs肠杆菌科细菌感染的治疗，目前临床中主要是应用碳青霉烯类抗菌药物，临床疗效显著，但最近，肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶(KPC)在国内外的报道越来越多[6-7]。对于临床分离的肺炎克雷伯菌，主要是产头孢菌素酶(AmpC)、KPC及ESBLs。本研究对本院分离的多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药性进行分析，旨在对临床合理用药产生指导性意义，并对此种细菌在医院内的感染加以有效控制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1菌株来源 2015年1月至2016年12月来自临床住院患者痰、咽拭子、尿液、血液等标本分离的286株肺炎克雷伯菌。

1.2仪器与试剂 TDR-300B微生物鉴定分析仪，比浊仪，ESBLs检测试剂盒，MH琼脂平板，OXOID药敏纸片，游标卡尺，离心机，三洋低温冰箱MDFU32V。

1.3方法

1.3.1药敏试验 采用纸片扩散法(K-B法)和最低抑菌浓度(MIC)试验检测肺炎克雷伯菌对阿米卡星(AK)、庆大霉素(CN)、氨苄西林(AMP)、氨苄西林/舒巴坦(SAM)、哌拉西林(PIP)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、妥布霉素(TOB)、亚胺培南(IMP)、头孢曲松(CRO)、头孢唑啉(KZ)、头孢他啶(CAZ)、头孢呋辛(CXM)、头孢吡肟(FEP)、头孢噻肟(CTX)、头孢西丁(FOX)、氨曲南(ATM)、复方磺胺甲噁唑(SXT)、洛美沙星(LOM)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)等药物的耐药性。判定标准依据美国临床和实验室标准协会(CLSI)(2014年版)的规定。

1.3.2ESBLs表型筛选与确证试验 筛选出药敏试验中抑菌环直径CAZ≤22 mm或CTX≤27 mm或CRO≤25 mm或ATM≤27 mm的菌株为疑产ESBLs株。对疑产ESBLs菌株再采用K-B法进行确证试验,使用每片含30 μg CAZ、CTX纸片和头孢他啶/克拉维酸(CAC，30 μg/10 μg)、头孢噻肟/克拉维酸(CTC，30 μg/10 μg)复合纸片进行试验，当任何一种复合药敏纸片抑菌圈直径与其单独药敏纸片抑菌圈直径之差≥5 mm,即可确认为产 ESBLs株。

1.3.3KPC表型筛查试验 采用K-B法，根据CLSI(2014年版)标准，美罗培南(MEM，10 μg)或IMP(10 μg)抑菌圈直径≤22 mm为表型筛查阳性。

1.3.4产新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1)表型确诊试验 双纸片协同试验采用IMP(10 μg)或MEM(10 μg)/乙二胺四乙酸(EDTA,1 500 μg)两种纸片(K-B法)，两纸片距离10～15 mm，在含EDTA纸片方向处，MEM或IMP抑菌圈直径扩大，即可判定产NDM-1；组合纸片法采用IMP(10 μg)或MEM(10 μg)/EDTA复合纸片进行K-B法试验，复合纸片比单药纸片的抑菌圈直径增大值为≥5 mm，即可判定产NDM-1。

1.3.5改良霍奇试验 制备好0.5麦氏浊度的大肠埃希菌ATCC25922菌悬液，然后将菌悬液进行10倍稀释，并使用棉签将其均匀地涂布于MH平板中，然后在平板中央贴含10 μg MEM的纸片。使用接种环挑取受试菌自纸片边缘向平板边缘划线接种。35 ℃孵育过夜，如果矢状生长存在于MEM抑菌圈与待测菌株接种线交界处，则说明产KPC呈阳性。

1.3.6AmpC表型筛选及确认 采用FOX纸片使用琼脂扩散法检测临床分离菌株。当抑菌圈直径≤18 mm时,说明对FOX产生耐药或中介，可能为产AmpC菌株,提示AmpC表型筛选呈现阳性。AmpC的确认试验：FOX三维确认试验是检测AmpC的经典方法，在涂布了0.5麦氏浊度大肠埃希菌标准菌株的平板上贴FOX纸片，向离心方向使用无菌刀片切一裂隙，距纸片边缘5 mm处，将30～40 μL的待检菌株β-内酰胺酶初提液(过滤或低温超速离心除去活菌)加入裂缝中，并防止酶初提液溢出裂隙，进行过夜培养，温度在35 ℃，如果细菌生长于抑菌圈内裂隙旁，则说明产AmpC阳性。采取反复冻融法进行粗酶提取。

1.3.7质控菌株 质控菌株包括大肠埃希菌 ATCC25922及肺炎克雷伯菌 ATCC700603。

1.4统计学处理 数据统计应用WHONET5.4软件，采用SPSS13.0统计软件进行数据处理，产ESBLs与非产ESBLs的耐药率比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1标本分布 286株肺炎克雷伯菌主要分离自痰(228株，79.72%)、尿液(25株，8.74%)、伤口分泌物(16株，5.59%)。见表1。

2.2科室分布 286株肺炎克雷伯菌主要分布在ICU(56.29%)，呼吸内科(27.62%)，见表2。

2.3药敏试验比较 分离的286株肺炎克雷伯菌中，产ESBLs的肺炎克雷伯菌162株，检出率为56.64%，其耐药率远远高于非产ESBLs的肺炎克雷伯菌，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表1 肺炎克雷伯菌株标本类型分布构成比(%)

表2 肺炎克雷伯菌株在各科室分布构成比(%)

表3 产与非产ESBLs肺炎克雷伯菌株耐药率(%)

续表3 产与非产ESBLs肺炎克雷伯菌株耐药率(%)

2.4耐药表型分析 本研究286株肺炎克雷伯菌中产ESBLs菌株162株，检出率为56.64%；产AmpC酶菌株39株，检出率为13.64%；产KPC酶菌株28株，检出率为9.79%；产NDM-1菌株2株，检出率为0.70%。

3 讨 论

作为引起呼吸道感染为主要医院内感染的一种常见致病菌，肺炎克雷伯菌多造成肺、创面、泌尿系统及血液等的感染，导致患者出现菌血症、肺炎及尿路感染等。本研究对分离的286株来自临床患者的肺炎克雷伯菌进行分析，分离自痰和咽拭子的标本占81.47%，且临床分布主要在ICU和呼吸内科，表明该菌主要引起呼吸道感染，与文献报道较一致[8-9]。肺炎克雷伯菌由于受到抗菌药物广泛使用的影响，其耐药菌株呈现出逐年上升的趋势。在本研究中，肺炎克雷伯菌的耐药性主要体现在第二代头孢菌素中，与此同时，对第三代头孢菌素及第四代头孢菌素的耐药性也在持续增加，但是对碳青霉烯类抗菌药物(如IMP和MEM)的耐药率相对较低，但有逐年增高的趋势[10-11]。本研究检出产KPC肺炎克雷伯菌28株，检出率9.79%，应引起临床医生的重视，而造成此结果的主要原因可能是受到第三代头孢菌素和IMP/西司他丁钠应用于呼吸内科及ICU的影响，此次标本结果中共有产NDM-1的肺炎克雷伯菌患者2例，为防止该基因的扩散流行，临床及感控部门应引起重视。

由于第三代头孢菌素在临床中广泛使用，产ESBLs及高产AmpC的革兰阴性杆菌在持续增加,而且临床中广泛应用碳青霉烯类药物(如IMP),因此造成产KPC的肺炎克雷伯菌及大肠埃希菌的不断出现，同时产NDM-1的肺炎克雷伯菌也被检出，多重耐药和泛耐药的革兰阴性杆菌在临床不断被检出，并且面临着世界性流行，成为严重的社会问题，引起国内外卫生组织的广泛关注。

将产与非产ESBLs肺炎克雷伯菌的耐药性作为本次研究的重要分析内容，在耐药性方面，产ESBLs明显高于非产ESBLs菌株。作为肺炎克雷伯菌的多重耐药机制，产ESBLs的菌株能够对广谱青霉素和第一、二、三代头孢菌素产生分解作用，与此同时甚至能够水解第四代头孢菌素等β-内酰胺类抗菌药物，其对氨基糖苷类及喹诺酮类抗菌药物的耐药性也相对较高。本研究结果显示，产ESBLs肺炎克雷伯菌菌株中对含酶抑制剂的复合抗菌药物SAM耐药率高达95.06%，说明SAM已经不适应于临床对产ESBLs菌株引起感染的治疗，TZP耐药率相对较低，但也有20.99%。本研究中，产AmpC检出率为13.64%(39株)，其中12株同时产ESBLs和AmpC菌株直接影响了复合抗菌药物(含酶抑制剂)对产ESBLs肺炎克雷伯菌的临床治疗效果，但是产ESBLs菌株对IMP等碳青霉烯类抗菌药物具有较高的敏感性，临床上仍可直接用于治疗产ESBLs肺炎克雷伯菌引起的重度感染。

本研究结果显示，产ESBLs肺炎克雷伯菌检出率为56.64%，与国内报道的结果相近[12]，表明本院也普遍存在较为严重的ESBLs菌株流行，其耐药机制主要包括：抗菌药物渗透障碍、改变抗菌药物作用靶点、产生抗菌药物主动外排机制、产生抗菌药物灭活酶并在菌种间经多种途径进行耐药基因的传播。抗菌药物在医院、社区滥用是产生ESBLs耐药菌株的重要原因，为降低产ESBLs菌株的发生率，应加强控制抗菌药物的使用，抑制耐药菌株的流行，建立细菌耐药检测体系，及时开展快速检测产ESBLs、NDM-1、AmpC及KPC，确保为抗菌药物在临床中的合理使用提供更直接、更有效的证据，以指导临床合理用药，控制多重耐药菌株的产生与传播，防止耐药株产生，引发医院内感染。