烧伤科患者分离金黄色葡萄球菌耐药性和耐药基因分析*

付晓蕊，康蓓佩，徐修礼，马越云，周 磊

空军军医大学西京医院检验科/全军临床检验医学研究所，陕西西安 710032

烧伤在人们的生活中时有发生。烧伤创面由于存在大量的坏死与变性组织，使得皮肤作为人体抵御微生物入侵的天然屏障被破坏，容易引起细菌定植，当细菌入侵到皮肤表面的渗出液或者坏死组织并且达到一定数量时，就会出现化脓性感染、脓毒症等全身症状[1]。常见的感染病原体为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、弗氏枸橼酸杆菌及其他肠道阴性杆菌，尤其是当烧伤患者受到金黄色葡萄球菌感染时，更易引发全身化脓性感染或者毒素性疾病。20世纪60年代欧洲确认了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)后，各种各样的耐药菌株相继出现，且其耐药范围日益扩大，耐药程度日益严重。20 世纪90 年代后期又出现了耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(VRSA)[2]及万古霉素中介金黄色葡萄球菌(VISA)[3]。本文着重分析本院烧伤科患者创面分泌物分离的金黄色葡萄球菌的耐药性和耐药基因分布，旨在为临床医生挑选有效抗菌药物、促进患者恢复健康提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2018年10月至2019年4月本院烧伤科分离的135株金黄色葡萄球菌，标本均为烧伤创面分泌物，剔除同一患者的重复标本。质控菌株ATCC25923、ATCC29213、ATCC43300由国家卫生健康委员会临床检验中心提供，于本室保存。

1.2方法

1.2.1菌种鉴定和药敏试验 采用法国生物梅里埃VITEK-Ⅱ Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统，药敏试验的解释标准、结果判读参照2018年美国临床和实验室标准化协会(CLSI)标准。

1.2.2细菌基因组DNA制备 无菌条件下将收集的金黄色葡萄球菌接种在血琼脂平板上，35 ℃培养箱中培养18～24 h，挑取6～8个单个菌落置于0.5 mL无菌生理盐水中，充分震荡混匀，95 ℃煮沸15 min，12 000 r/min离心5 min后取上清液即为所需粗提细菌基因组DNA溶液。

1.2.3PCR基因扩增 反应体系共25 μL，包括Premix Tap缓冲液12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，蒸馏水9.5 μL。反应过程：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共循环35次，结束后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。耐药基因引物序列及扩增片段长度[1]见表1。

表1 PCR引物序列和产物长度

续表1 PCR引物序列和产物长度

1.2.4产物检测 取5 μL扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用紫外凝胶成像系统观察结果。

1.3统计学处理 应用WHONET5.6统计学软件进行数据分析，统计金黄色葡萄球菌的耐药率、中介率和敏感率。

2 结 果

2.1金黄色葡萄球菌耐药率 分析135株烧伤患者分泌物标本金黄色葡萄球菌药敏检测结果，其对多种抗菌药物耐药，只对少数药物敏感。其中对青霉素的耐药率为97.0%，对利福平耐药率为72.6%，对庆大霉素、红霉素、克林霉素和四环素耐药率均超过60.0%；对利奈唑胺、万古霉素、替考拉宁、奎奴普汀/达福普利和替加环素都高度敏感，敏感率均为100.0%，对复方磺胺甲噁唑和莫西沙星的敏感率分别高达92.6%和85.9%，对左氧氟沙星的敏感率为65.9%，具有较好的抗菌活性。见表2。

表2 135株金黄色葡萄球菌对抗菌药物的耐药率、中介率和敏感率(%)

2.2MRSA和MSSA相关抗菌药物的耐药率及耐药基因检测情况 基因检测mecA基因阳性可以判断为MRSA，本试验检测中有73株金黄色葡萄球菌为MRSA，62株金黄色葡萄球菌为对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌(MSSA)。在135株金黄色葡萄球菌中，耐药基因以mecA、ermA、ermC和aac6′/aph2′为主。β-内酰胺类抗菌药物相关耐药基因mecA、TEM检测阳性率分别是54.1%和32.6%，大环内酯类相关耐药基因ermA、ermB、ermC检测阳性率分别为51.9%、28.1%、62.2%，氨基糖苷类相关耐药基因ant6、aac6′/aph2′基因检测阳性率分别为17.0%、62.2%，见表3。在135株金黄色葡萄球菌中73株为MRSA，62株为MSSA。MRSA和MSSA对β-内酰胺类抗菌药物苯唑西林耐药率分别为100.0%、0.0%，对大环内酯类抗菌药物代表药物红霉素的耐药率分别为78.1%、46.8%，对氨基糖苷类抗菌药物代表药物庆大霉素的耐药率分别为93.2%、40.3%，与相关耐药基因比较基本一致，主要还是以mecA、ermA、ermC和aac6′/aph2′为主，见表4。

表3 MRSA和MSSA的耐药基因阳性率

表4 MRSA和MSSA相关抗菌药物的耐药情况

3 讨 论

烧伤患者创面存在大量的坏死与变性组织，创面周围常有红肿、出血点或坏死斑，当机体全身营养支持疗法不当、蛋白质摄入不足致使机体长期消耗容易引起细菌感染。近些年抗菌药物的大量使用使得金黄色葡萄球菌对抗菌药物耐药率持续增加，烧伤创面感染越发难以恢复[4]，甚至于在MRSA出现以后，已经严重威胁到患者生命。MRSA同时对多种抗菌药物耐药，有氨基糖苷类、β-内酰胺类、利福霉素类、喹诺酮类、大环内酯类、林可胺类等，这也是临床抗感染治疗的一大难题[5-6]。

本研究药敏结果显示，135株金黄色葡萄球菌对多数抗菌药物耐药率较高，只对少数药物敏感，对青霉素的耐药率为97.0%，几乎完全耐药。对替考拉宁、利奈唑胺、奎普奴丁/达福普利、替加环素和万古霉素高度敏感，敏感率均为100.0%。试验结果表明，糖肽类抗菌药物对金黄色葡萄球菌感染效果最好，这也就出现了近些年临床上金黄色葡萄球菌感染常规使用万古霉素，有文献报道已经出现了MRSA及VISA[2-3]。

金黄色葡萄球菌mecA基因编码一种特殊的青霉素结合蛋白PBP2a(或PBP2′)，此蛋白极大地降低了与β-内酰胺类抗菌药物的亲和力从而产生耐药性，CLSI指出在金黄色葡萄球菌菌体中检测到mecA基因或者PBP2α蛋白即可判定为MRSA[7]。本研究中有73株菌株判定为MRSA，检出阳性率为54.1%，与近年CHINET细菌耐药监测网报道MRSA平均检出率相当[8]。mecA基因阳性率为54.1%，苯唑西林耐药率为54.8%，耐药表型与耐药基因略有差异，推断是可能存在其他耐药机制，比如可能是获得性PBP2α以外的其他PBPs的修饰，由质粒介导后产生水解青霉素类药物的β-内酰胺酶[9]，或者苯唑西林临界耐药金黄色葡萄球菌(BORSA)高产β-内酰胺酶等。TEM基因是另外一个β-内酰胺酶基因，总阳性率为32.6%。

有研究报道，MSSA相对MRSA毒力基因携带率更高，提示关注MRSA的同时，不能轻视MSSA感染[10]。本研究中MRSA和MSSA氨基糖苷类相关耐药基因主要为ant6和aac6′/aph2′，文献报道的MRSA主要携带aac6′/aph2′基因[10]，MSSA主要携带ant6基因[11]。MRSA菌株庆大霉素耐药率为93.2%,aac6′/aph2′基因的阳性率为62.2%，耐药基因阳性率低于耐药表型，不排除可能存在其他耐药相关基因或者其他耐药机制，比如aph(3)-Ⅲ基因、ant4′基因等[12]。一般认为，90%以上对氨基糖苷类耐药的葡萄球菌至少包含一个编码氨基糖苷类抗菌药物修饰酶的基因[13]。MSSA庆大霉素耐药率(40.3%)高于ant6基因的阳性率(17.0%)，同样也不排除可能存在其他耐药相关基因或者其他耐药机制。

近年来，大量大环内酯类药物在临床中应用，导致红霉素的耐药性也在逐年提升。erm家族耐药基因主要有ermA、ermB、ermC和ermF，其编码的RNA甲基化酶对23S rRNA特定核苷酸残基甲基化，erm基因上游的启动子发生突变而使erm基因持续、稳定地表达导致大环内酯类药物耐药。文献显示，葡萄球菌主要以ermA和ermC基因为主[14]。在本研究中，ermA、ermB和ermC基因阳性检出率分别为61.9%、28.1%和62.2%。MRSA耐药基因以ermA和ermC基因为主，与JONES等[15]的报道一致，该结果较红霉素耐药率(78.1%)低，也就是说部分菌株同时存在2种或者2种以上耐药基因，或者还有其他耐药相关基因，比如文献报道的msrA基因[16]和mphC基因[17]等；MSSA以ermC为主，耐药基因阳性率高于红霉素耐药率，也就是说ermC基因可能不止与红霉素耐药相关，可能同时在其他非红霉素的大环内酯类药物导致的耐药中也存在。

综上所述，烧伤科患者感染金黄色葡萄球菌对多数抗菌药物耐药率较高，耐药基因以mecA、ermA、ermC和aac6′/aph2′为主，MRSA耐药基因阳性率一般高于MSSA，MRSA防控形势不容乐观。对于感染金黄色葡萄球菌的烧伤患者，临床医生应及时处理烧伤创面，并结合降钙素原(PCT)和白细胞介素6(IL-6)水平监测患者预后，一般PCT和IL-6同时升高是预后不良的危险因子[18]，及时挑选合理、有效的抗菌药物并控制药量，减少抗菌药物的滥用，治疗MRSA感染并且预防高耐药、高毒力的MRSA交叉传播，尽早在休克平稳或其他并发症基本控制后行植皮术，有效减少烧伤患者感染和创面愈合不良。从医院内感染的角度，烧伤患者分离的金黄色葡萄球菌中mecA基因检出率较高，提示其对季胺类消毒剂消毒皮肤效果可能欠佳[11]，医院感染控制部门应加强细菌的耐药性监测，有效控制多重耐药菌的感染[19]。