38种中草药对大菱鲆源副溶血弧菌的抑杀效果

任 海，华智杰，魏云卓，王 宇，靳晓敏

(河北科技师范学院动物科技学院，河北 秦皇岛，066600)

弧菌病(Vibriosis)是世界各国海水养殖鱼、虾、蟹、贝类等水产动物危害最大的疾病，常给水产养殖业带来巨大的打击[1]。弧菌(Vibrio)是海洋环境中最常见一类条件致病菌，是水产业发展的主要限制因素之一。目前，国内外已经报道的弧菌病病原主要有鳗弧菌(V.anguillarum)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、拟态弧菌(V.mimicus)和创伤弧菌(V.vulnificus)等[2]。其中，副溶血弧菌为革兰氏阴性杆菌，有鞭毛，无荚膜及芽孢，广泛存在于养殖水域中，是海洋动物主要条件致病菌之一[3]，能够引起包括鱼、虾、蟹、贝等多种海水养殖动物发病，给水产业造成巨大的经济损失[4]。另外，该菌属于人畜共患病原菌，能够通过食源污染影响人类健康，常引起人体患急性肠胃炎并会伴有腹泻、呕吐、腹部痉挛等症状，严重者能够导致人体死亡[5]。近年来，已有相关文献报道副溶血弧菌可以侵染大黄鱼[6]、三斑鲹[5]、半滑舌鳎[7]、凡纳滨对虾[8]和九孔鲍[9]等多种水产动物。

目前对水产动物细菌性疾病防治方面，以使用化学合成药物和抗生素类药物为主。随着抗生素的频繁使用，许多细菌已经产生了耐药性问题，而且产生多重耐药菌株，细菌耐药性不断增强，致使临床感染死亡率不断增高[10,11]。在长期的使用过程中，人们逐渐认识到这些药物的不足之处，如预防作用弱，易产生耐药性，抗菌谱窄，污染水环境等[1]。我国中草药种类繁多，大部分价格低廉、来源方便、无毒副作用或者毒副作用低且不易产生耐药性，还具有提高水产动物免疫力，提高其抗应激能力等多重功效[12]。研究显示，很多具有清热、抗炎和解毒的中草药均具有抗菌作用[13]。王玉娥等[14]测定了10种常用中草药对5种海洋致病弧菌的抑菌情况，结果发现，五倍子和黄连可作为防治水产动物弧菌病的首选药物；王洪彬等[15]报道16种常用中草药对4种水产动物致病菌体外抑菌效果的研究中发现，苏木、女贞子、夏枯草、青皮均具有很好的抑菌作用。郑天伦等[16]研究了15种中草药对大黄鱼源溶藻弧菌的体外抑菌试验，结果发现石榴皮、地榆、五味子和大黄的抑菌能力最强。目前，副溶血弧菌对大菱鲆的危害已有相关报道[17]，但是对于中草药对大菱鲆源副溶血弧菌抑杀效果未见相关报道。为此，笔者针对副溶血弧菌选择了38种中草药，确定其抗菌作用，以期为大菱鲆养殖过程中防治副溶血弧菌病的临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

试验菌株来源于河北科技师范学院水产养殖实验室，分离于秦皇岛某养殖场患病大菱鲆，并经过形态特征、理化特点、致病性以及分子生物学鉴定证实为致病性副溶血弧菌。

1.2 中草药及其来源

选择的38种中草药为：大黄、郁金、柴胡、五倍子、车前子、紫锥菊、苏木、当归、栀子、青蒿、鱼腥草、黄芩、虎杖、贯众、苦参、淫羊藿、黄连、黄芪、黄柏、大青叶、连翘、白头翁、乌梅、穿心莲、地锦草、益母草、何首乌、甘草、地榆、秦皮、石榴皮、丁香、地丁、女贞子、川棘子、赤芍、茵陈、诃子，均购自河北省昌黎县百草堂药店。

1.3 主要试剂

营养琼脂，营养肉汤，96孔酶标板均购自北京康为世纪生物科技有限公司，其他试剂均由水产养殖实验室提供。

1.4 主要仪器

电子天平CP224C，奥豪斯仪器有限公司生产；超净工作台ZRJH-C1112B，上海智城分析仪器制造有限公司生产；全温振荡培养箱BSD-100，电热恒温培养箱HPX-9082MBE，电热鼓风干燥箱GZX-9076MBE，均为上海博迅医疗生物股份有限公司生产；高压蒸汽灭菌器MLS-3751L-PC，日本Panasonic公司生产。

1.5 试验方法

1.5.1中草药药液的制备 将上述38种中草药分别称取10 g放到400mL烧杯中，用蒸馏水浸泡3 h后用大火煮至沸腾，文火煎1 h，第一次煎煮药物时需要加入400 mL蒸馏水，然后再用6层纱布过滤，过滤后的药渣中再加入200 mL的蒸馏水用文火煮大约1 h，消毒纱布过滤后，将两次所得药液定容至50 mL，制成200 g/L[10,11]的中草药原药液，装瓶、高压灭菌后置于冰箱4 ℃备用。

1.5.2牛津杯打孔培养基的制作 将固体培养基从高压蒸汽灭菌器内拿出，放到超净工作台内，待冷却到大约60 ℃，摇匀后倒入到玻璃平板一层，使液体培养基均匀覆盖玻璃平板底部即可，待冷却凝固后小心放入牛津杯，每个玻璃平板均匀放置5个牛津杯，然后再缓缓倒入第二层培养基，厚度大约为整个平板的2/3即可，待培养基冷却凝固后小心取出牛津杯，将平板置于冰箱4 ℃备用。

1.5.3菌种的活化 将副溶血弧菌置于普通营养琼脂培养基上，28 ℃培养24 h，整个过程在超净工作台中进行操作。

1.5.4试验菌液的制备 取出活化好的副溶血弧菌平板，用接种环在无菌条件下挑取菌落，将菌落溶解到1 mL无菌生理盐水中制成菌悬液，参照麦氏比浊管使其浓度达到1×1011cfu/L。

1.5.5抑菌效果判定 采用牛津杯打孔培养基进行体外抑菌试验测定，每种中草药重复测定3次，取其平均值作为最终抑菌直径。具体为：首先把菌液用灭菌棉签均匀涂布于打孔培养基上，然后将中草药药液分别加入到每个孔内，以加满而不溢出孔外为宜，置于28 ℃恒温培养箱中培养24 h，测定抑菌圈直径。判定标准以抑菌圈直径≥20 mm判定为高度敏感(HS)，在10～19 mm判定为敏感(S)，<10 mm判定为耐药(R)。

1.5.6最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定 采用菌液涂布法和改良微量二倍稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，具体操作参考任海等[12]和张月娥等[14]的方法。

2 结果与分析

2.1 38种中草药对副溶血弧菌的抑菌作用

副溶血弧菌对38种中草药敏感程度的试验结果表明：大菱鲆源副溶血弧菌对诃子、秦皮、石榴皮、黄连、黄芩、五倍子高度敏感，其抑菌圈直径为20～27 mm(表1)，其中五倍子的抑菌作用最强，抑菌圈直径为27 mm；其次为石榴皮和黄连，抑菌圈直径为25 mm；对淫羊藿、青蒿、丁香、地榆、栀子、连翘、苏木、乌梅、赤芍、地锦草、女贞子、黄柏、虎杖、白头翁、川棘子敏感，其抑菌圈直径为11～19 mm；对益母草、贯众、甘草、大黄、大青叶、茵陈、郁金、当归、黄芪、柴胡、何首乌和穿心莲不敏感。

表1 38种中草药对副溶血弧菌的抑菌作用 mm

注：敏感性判定标准以抑菌圈直径≥20 mm判定为高度敏感(HS)；抑菌圈直径10～19 mm判定为敏感(S)；抑菌圈直径<10 mm的判定为耐药(R)；无抑菌圈形成记作0。

2.2 21种对副溶血弧菌有抑菌作用的中草药对副溶血弧菌的MIC

由表1结果中选取具有抑菌作用的21种中草药进行副溶血弧菌的MIC测定。结果表明：21种中草药对副溶血弧菌有不同程度的抑菌作用(表2)。其中抑菌效果最好的为五倍子、秦皮、黄连、黄芩、诃子和石榴皮，对副溶血弧菌抑菌效价均达到1∶128，即MIC为1.56 g/L；其次为淫羊藿、丁香、地榆、栀子、连翘、地锦草、苏木、赤芍、乌梅和青蒿，抑菌效价为1∶64，即MIC为3.13 g/L；女贞子、黄柏、虎杖和川棘子的抑菌效价为1∶16，即MIC为12.50 g/L；白头翁抑菌效价最低，为1∶8，即MIC为25.00 g/L。

2.3 21种对副溶血弧菌有抑菌作用的中草药对副溶血弧菌的MBC

由表1结果中选取具有抑菌作用的21种中草药进行副溶血弧菌的MBC测定。结果表明：21种中草药对副溶血弧菌有不同程度的杀菌效果(表3)。其中以秦皮、五倍子、黄连、石榴皮、诃子、黄芩的杀菌效果最好，对副溶血弧菌的杀菌效价均达到了1∶64，即MBC为3.13 g/L；其次为淫羊藿、青蒿、丁香、地榆、栀子、连翘、地锦草、苏木、乌梅和赤芍，杀菌效价均达到1∶32，即MBC为6.25 g/L；女贞子、黄柏、虎杖和川棘子的杀菌效价均达到1∶8，即MBC为25.00 g/L；白头翁杀菌效价最低，为1∶4，即MBC为50.00 g/L。

3 讨 论

近年来，中草药被广泛用于水产动物细菌性疾病的防治中。有关中草药防治不同水产动物来源的副溶血弧菌病已经有过多篇记载和报道。梁利国等[18]研究常用中草药对4种病原弧菌体外抗菌效果中发现，五倍子、苏木、黄芩、地锦草和石榴皮等对副溶血弧菌具有较好的抑菌效果；王玉娥等[14]研究副溶血弧菌对34种中草药的敏感性测定试验中的结果表明，副溶血弧菌对五倍子、黄连和乌梅等具有比较高的敏感性；毛芝娟等[19]的试验也发现，五倍子煎煮液对溶藻弧菌和副溶血弧菌均有很强的抑菌活性；侯竹美[20]研究证实，五倍子和石榴皮对副溶血弧菌有较强抑菌作用；李华等[21]研究发现，五倍子、石榴皮、黄芩、黄连和乌梅的对副溶血弧菌的抑杀效果较为明显。本次试验结果显示，大菱鲆源副溶血弧菌对黄连、五倍子、秦皮、诃子、石榴皮、黄芩、苏木、乌梅、连翘和黄柏等均具有很强的敏感性，抑菌直径达到20 mm以上，其中五倍子、黄连和石榴皮对副溶血弧菌均具有高度的敏感性，抑菌直径达到25 mm以上，本次试验结果与上述研究者的研究结果相似。另外，本次试验结果发现，大黄、当归和穿心莲对副溶血弧菌无抑菌作用，该结果与毛芝娟等[19]研究的大黄对锯缘青蟹源副溶血弧菌具有强的抗菌性结果相反，出现这种情况的原因可能是由于中草药和供试菌株的不同来源导致药物对其敏感性存在差异[22]。药物对弧菌的作用有选择性的，而不同来源的弧菌对不同药物的敏感性也是有差异的。因此，在杀灭不同来源弧菌时选择敏感的药物显得尤为重要。

笔者利用微量二倍稀释法和液体涂布法，进一步确定了本次试验中具有抑菌效果的21种中草药对大菱鲆源副溶血弧菌的MIC和MBC。结果发现，五倍子、秦皮、黄连、黄芩、诃子和石榴皮的MIC和MBC最好，抑菌和杀菌效价分别达到了1∶128和1∶64，即MIC和MBC分别为1.56 g/L和3.12 g/L。毛芝娟等[19]研究了石榴皮、五倍子、穿心莲、大黄等中草药对副溶血弧菌的抑菌和杀菌作用，发现五倍子煎煮液对副溶血弧菌有很强的抑菌和杀菌作用，MIC和MBC均达到1.56 g/L和3.12 g/L。本次试验结果也发现五倍子对副溶血弧菌敏感性最好。李华等[21]研究几种中草药对海水养殖中常见病原菌的抗菌作用中也发现，五倍子和石榴皮的抑菌杀菌效果最好，而白头翁效果一般。王玉娥等[14]的研究结果证实，白头翁对副溶血弧菌效果差。本次试验结果也发现，白头翁的MIC和MBC最差，与上述学者研究结果相似。另外，本次试验结果发现，大菱鲆源副溶血弧菌与其他水产动物来源的副溶血弧菌，抑菌杀菌敏感中草药的种类具有很高的相似性。因此，在实际生产中可以考虑选用敏感中草药作为防治不同动物源副溶血弧菌的药物。

表2 21种中草药对副溶血弧菌的MIC g/L

注：“-”表示平板上无菌生长或少量菌生长；

“+”表示平板上有大量菌生长。

表3 21种中草药对副溶血弧菌的MBC g/L

注：“-”表示平板上无菌生长；“+”表示平板上有菌生长。

4 结论与建议

本次试验采用38种中草药对副溶血弧菌进行体外抑菌效果测定，结果表明，石榴皮、黄芩、诃子、五倍子、黄连等中草药的抑菌和杀菌能力最强，其抑菌直径20～27 mm，MIC和MBC分别为1.56 g/L和3.13 g/L；其次是淫羊藿、青蒿、丁香、地榆、栀子等，抑菌直径为11～19 mm，其MIC和MBC分别为3.13 g/L和6.25 g/L。在实际生产中建议用价格相对较低，抑菌效果较好的石榴皮、五倍子、黄芩和丁香对大菱鲆源副溶血弧菌进行抑杀。