双斑长跗萤叶甲成虫粪便活性成分鉴定

李 伦，杨 陈，陈 静

(石河子大学农学院 / 新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用重点实验室，新疆石河子 832003)

0 引 言

【研究意义】双斑长跗萤叶甲Monoleptahieroglyphica(Motschulsky) 属于鞘翅目Coleoptera，叶甲科Chrysomelidae，分布于我国大部分地区，主要为害玉米和棉花等多种作物[1,2]。该叶甲成虫取食寄主植物的叶表皮及叶肉，易形成花叶以及对叶片造成孔洞，进而对棉花的生产造成严重影响[3]。近年来，双斑长跗萤叶甲对新疆地区的棉花等作物的危害日益严重，已逐渐成为部分区域棉花等作物上的主要害虫[4]。长期使用化学药剂已使该叶甲产生抗药性，且污染环境[5]。寻找有效的防治方法，对利用活性化合物防治叶甲有实际意义。【前人研究进展】昆虫信息化学物质是用来影响和控制同种昆虫不同个体之间聚集、防御等多种行为的化合物，其中昆虫聚集信息素(aggregation pheromone)，一般产生于昆虫个体且通过其排泄物释放，能够引起雌雄两性同种昆虫的聚集行为[6]。鞘翅目昆虫聚集信息素的来源，一昆虫雌性体表挥发物[7]，二是昆虫粪便挥发物[8]，三是昆虫危害诱导出的植物挥发物[9]。聚集信息素成分复杂，已鉴定出的鞘翅目昆虫聚集信息素的主要成分为一些烃、醇、醛、酮、酯、酸类化合物，同一个科的昆虫聚集信息素化学结构相差不是很大，且多数昆虫同属的聚集信息素组分极为相似[6,10]。同一性别的蠹虫所分泌的信息素往往包括三、四个甚至更多化合物的混合物[11]。长小蠹Platypus聚集信息素的化学成分主要是烯醇类[12]。十字花科跳甲Phyllotretacruciferae聚集信息素由多种萜烯类化合物组成的[13]。目前，昆虫聚集信息素主要应用于害虫诱杀和虫情监测等方面[14,15]。例如,从华山松木蠹象Pissodespunctatus的新鲜虫粪和雄虫后肠中发现的聚集信息素活性成分对华山松木蠹象表现出一定的引诱作用[16]。泽桑梓等[17]通过GC-MS分离鉴定出1-甲基-2-异丙烯基-环丁烷乙醇在林间引诱试验中对华山松木蠹象有较好的效果；范丽华等[18]也通过GC-MS分离鉴定出十八烷、十九烷、十二酸和十四酸对脐腹小蠢Scolytusschevyrewi有引诱性，并推断其为脐腹小蠢聚集信息素的主要成分。利用昆虫聚集信息素对该叶甲进行防治，是实现害虫可持续控制的一种新的有效防治途径。【本研究切入点】从双斑长跗萤叶甲为害玉米和棉花后诱导出的挥发物中，雌、雄虫对α-长叶蒎烯、3-蒈烯、γ-萜品烯、β-紫罗酮以及月桂烯等的EAG反应效果较好；行为反应表明，γ-萜品烯对雄虫具有一定的引诱效果，β-紫罗酮对雌虫具有一定的引诱效果[19,20]。由于昆虫聚集信息素来源多样化[21,22]。昆虫粪便挥发物中的一些成分可能对昆虫的聚集和趋避行为起着重要作用[23]，已知非洲飞蝗(Locustamigratoria)蝗蝻的粪便中含有群居信息素[24]。石旺鹏等[25]对东亚飞蝗的研究表明，该虫活性较高的聚集信息素来源于其粪便中。双斑长跗萤叶甲成虫在棉田呈聚集型分布[26]，是否与其粪便挥发物起到一定的聚集作用，尚未报道。研究鉴定双斑长跗萤叶甲成虫粪便活性成分。【拟解决的关键问题】研究通过GC-MS采集鉴定双斑长跗萤叶甲粪便挥发性化合物的组分和含量，利用触角电位仪和“Y”型嗅觉仪测定双斑长跗萤叶甲雌、雄成虫对其粪便挥发物的电生理和行为反应，筛选出双斑长跗萤粪便挥发物中对该叶甲具有聚集趋性的活性化合物，为研究该叶甲的聚集信息素奠定基础，为利用活性化合物对该叶甲进行综合防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试昆虫

双斑长跗萤叶甲成虫采自石河子大学农学院试验站棉花田及周边杂草，在特定的养虫装置内用棉花叶片饲养该虫，将其放入PXZ型智能培养箱，光照周期设置为 L∶ D = 16∶ 8，温度为(26 ± 1)℃，备用。

1.1.2 供试仪器

气相色谱-质谱联用仪GCMS-7890A-5975C(安捷伦，美国)；触角电位仪(Syntech，荷兰) ；“Y”型嗅觉仪(主管长15 cm，两臂10 cm，内径均为0.7 cm，两测试臂夹角60°)。

1.2 方 法

1.2.1 双斑长跗萤叶甲粪便挥发物组成的测定

在特制的养虫装置中放入30只健康的双斑长跗萤叶甲成虫，并在底部垫滤纸和新鲜的棉花叶片，之后将装置放入培养箱中，24 h后收集新鲜粪便，除杂后将粪便收集在10 mL离心管中，将其密封、称重、记录，然后保存在4℃的冰箱中。试验参照张增强[27]的方法，采用固相微萃取法采集双斑长跗萤叶甲粪便挥发物：称取6 g供试粪便，放入10 mL的萃取瓶中塞紧，在50℃的水浴锅中加热15 min，将100 μm的萃取纤维头(PDMS)装入萃取手柄内活化30 min，之后将其插入萃取瓶内萃取50 min，取样完毕后放入290℃气化室脱附10 min。通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对采集到的双斑长跗萤叶甲粪便挥发物进行定性分析，色谱柱是PE-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，氦气作为载气，流速为1 mL/se；使用手动固相微萃取进样器(SPME)，进样口温度为250℃；升温程序是：起始柱温50℃，保持3 min，再以3℃/min 升温至200℃，5℃/min升温至280℃保持30 min。质谱条件为：电离源为EI，离子源温度为230℃, GC-MS传输线温度为200℃，质量扫描范围为35～600 amu，EI电离能量为70 eV。检索普库为Nist 2008版。

1.2.2 触角电生理反应

测定步骤参照刘航等[28]的方法，用眼科手术剪刀将双斑长跗萤叶甲成虫触角从根部剪下，再除去触角尖端1 mm，将剪好的触角两端搭在探头两端用导电胶固定。滴加10 μL粪便挥发物在滤纸条(35 mm×5 mm)上，将其放入1 mL的枪头中连接混合出气管且距离触角1 cm，连续刺激气体流量为500 mL/min，每次刺激1 s，间隔60 s进行下1次刺激。每个测试样6次重复，在测试开始和结束时，用石蜡各测试1次作为对照，以校正样品EAG值。

1.2.3 嗅觉行为反应

测定步骤参照张志虎等[29]方法，试验选择在较暗的室内进行，温度为(25±1)℃，测试时在装置上方安置2盏40 W的台灯。装置两臂用Teflon管连接气味源装置、流量计、加湿器、活性炭过滤器、大气采样仪。气体流速设为500 mL/min。供试昆虫采用饥饿处理12 h的雌、雄双斑长跗萤叶甲成虫，当叶甲越过主管长度1/2处，开始计时并观察其选择性。当该叶甲越过1/3测定臂，记为做出选择；若3 min后无选择趋向，记为无选择。每头叶甲测1次，每测5头成虫后将两臂互换位置，以消除误差。雌、雄虫一组各测试20头，重复4次，共80头。完成后用95%乙醇清洗装置，晾干待用。

1.3 数据处理

利用SPSS 20.0进行方差分析和Duncan多重比较，雌、雄虫对同一挥发物EAG反应值的差异显著性采用独立样本t检验进行检测。

嗅觉行为反应数据采用χ2检验双斑长跗萤叶甲成虫在2个气味源间的选择结果是否呈假设40∶40的理论分布，并且计算χ2值和相应的显著性水平P值。

2 结果与分析

2.1 双斑长跗萤叶甲成虫粪便挥发物化学成分

研究表明，从双斑长跗萤叶甲成虫粪便的挥发物中检测出29种化合物，其中挥发性成分以酯类化合物居多，约占69.28%；酮类、酚类和醛类化合物所占比例较少；烯类化合物中(Z)-γ-红没药烯、α-石竹烯和α-蒎烯等含量较多；醇类化合物中1-十四烷醇、1-十七烷醇和α-红没药醇为主要成分；烷类化合物中十八烷和十九烷居多；酸类化合物为壬酸和棕榈酸且含量较少。单一化合物中总含量最高的为己二酸二辛酯，占总含量的55.30%，其次为邻苯二甲酸-2-戊酯丁酯占总含量的7.04%。表1

2.2 双斑长跗萤叶甲雌、雄成虫对4种粪便挥发物的电生理反应

研究表明，从29种化合物中选取α-蒎烯、α-红没药醇、α-石竹烯、棕榈酸来测定雌、雄双斑长跗萤叶甲成虫对这4种挥发物的10、1、10-1和10-2μL/mL 4个浓度的EAG反应。表2

2.2.1 双斑长跗萤叶甲雄成虫对4种挥发物的EAG反应

双斑长跗萤叶甲雄虫对10、1、10-1和10-2μL/mL 4个浓度的α-蒎烯，10 μL/mL浓度的α-红没药醇，10和1 μL/mL 2个浓度的α-石竹烯EAG反应效果较为明显，对10、1、10-2μL/mL 3个浓度的棕榈酸，10-2μL/mL的α-红没药醇反应值相对较小。在4种挥发物中，双斑长跗萤叶甲雄虫对10 μL/mL的α-红没药醇反应值最大，对α-红没药醇和α-蒎烯的反应值随挥发物浓度的增加而增大，对α-石竹烯的反应值随挥发物浓度的增加先减小后增大。

2.2.2 双斑长跗萤叶甲雌成虫对4种挥发物的EAG反应

双斑长跗萤叶甲雌虫对10、1和10-2μL/mL 3个浓度的α-蒎烯，10、1和10-1μL/mL 3个浓度的α-红没药醇，10、1和10-2μL/mL 3个浓度的α-石竹烯EAG反应效果较为明显，对10和1 μL/mL 2个浓度的棕榈酸，10-1μL/mL的α-石竹烯反应值相对较小。在4种挥发物中，双斑长跗萤叶甲雌虫对10 μL/mL的α-红没药醇反应值最大，对α-红没药醇的反应值随挥发物浓度的增加而增大，对α-蒎烯和α-石竹烯的反应值随挥发物浓度的增加先减小后增大。

2.3 双斑长跗萤叶甲雌、雄成虫对4种粪便挥发物的嗅觉行为反应

根据EAG反应的结果，选取10 μL/mL的α-蒎烯、α-红没药醇、α-石竹烯和10-1μL/mL棕榈酸与对照液体石蜡进行行为反应测定。图1，图2

2.3.1 双斑长跗萤叶甲雄虫对4种挥发物的嗅觉行为反应

研究表明,在4种挥发物中，雄双斑长跗萤叶甲成虫对4种挥发物的偏好性从强到弱依次为α-红没药醇(χ2= 7.54，P<0.01，n = 80)>α-蒎烯(χ2= 5.69，P<0.05，n = 80)>棕榈酸(χ2= 0.17，P>0.05，n = 80)>α-石竹烯(χ2= 0.43，P>0.05，n = 80)，其中α-红没药醇和α-蒎烯对雄虫的引诱效果明显，达到显著性水平；棕榈酸和α-石竹烯对雄虫的引诱效果不明显，无选择性差异。图1

表1 双斑长跗萤叶甲成虫粪便挥发物的化学成分Table 1 Volatile composition of Monolepta hieroglyphica of feces

2.3.2 双斑长跗萤叶甲雌虫对4种挥发物的嗅觉行为反应

研究表明，在4种挥发物中，雌双斑长跗萤叶甲成虫对4种挥发物的偏好性从强到弱依次为α-红没药醇(χ2= 6.30，P<0.05，n = 80)>α-蒎烯(χ2= 4.41，P<0.05，n = 80)>棕榈酸(χ2= 0.58，P>0.05，n = 80)>α-石竹烯(χ2= 0.84，P>0.05，n = 80)，其中α-红没药醇和α-蒎烯对雌虫的引诱效果明显，达到显著性水平；棕榈酸和α-石竹烯对雌虫的引诱效果不明显，无选择性差异。图2

表2 双斑长跗萤叶甲对粪便中4种挥发物单品的EAG反应相对值Table 2 Relative EAG response of Monolepta hieroglyphica of 4 kind of volatile compounds of feces

注：表中数据为平均值 ± 标准误，数字后字母表示同种挥发物不同浓度在P< 0. 05 水平 Duncan多重比较结果;*表示相同浓度下雌、雄虫 EAG 反应值差异显著性(P< 0. 05)；**表示差异极显著性(P< 0.01)
Note：The date in the table are mean ± SE，and followed by letters indicate the results of same volatile on the different concentrations by Duncan’s multiple range test.*:P<0.05, different was significant;**:P<0.01, different was extremely significant

注：所得数据均经χ2检验，**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05)，NS表示无选择。下图同

Note:The data obtained were all tested by χ2,**indicates that the difference was extremely significant (P<0.01),*indicates significant difference (P<0.05), and NS indicates no choice. The same picture below

图1 双斑长跗萤叶甲雄成虫对4种挥发物单品的嗅觉行为反应
Fig.1 Behavior response ofMonoleptahieroglyphicaof male adults to the volatiles from four kinds

图2 双斑长跗萤叶甲雌成虫对4种挥发物单品的嗅觉行为反应
Fig.2 Behavior response ofMonoleptahieroglyphicaof female adults to the volatiles from four kinds

3 讨 论

植食性昆虫对一定浓度范围内的挥发性信息化合物的EAG反应率与挥发物浓度成正比[30]。在4种挥发物中，双斑长跗萤叶甲雄成虫对α-红没药醇和α-蒎烯的反应值随挥发物浓度的增加而增大，这与花绒寄甲、桃蛀螟雄虫的反应规律较相似[31,32]。双斑长跗萤叶甲雌成虫对α-红没药醇的反应值随挥发物浓度的增加而增大，这与光肩星天牛雌虫反应规律较相似[33]。t检验表明，雌双斑长跗萤叶甲在一定浓度的挥发物刺激下具有明显的EAG反应，且普遍高于雄虫，部分显著高于雄虫，在一定浓度的同种挥发物刺激下，雌虫触角的敏感性要高于雄虫。华山松大小蠹也存在这种类似现象[34]。不同性别的昆虫个体对同种挥发物的气味的反应存在着一定差异[35,36]，雌、雄双斑长跗萤叶甲成虫对同种浓度的α-红没药醇和棕榈酸刺激下反应差异极显著，对α-红没药醇和α-石竹烯个别浓度差异显著。松墨天牛雌、雄虫之间也存在这种相似现象[37]。双斑长跗萤叶甲成虫对α-红没药醇、α-石竹烯和α-蒎烯具有较好的EAG反应效果。这与张志虎[19]和刘航[28]的研究结果相似。说明在双斑长跗萤叶甲寄主植物挥发物和成虫粪便中都含有诱集该害虫的信息化合物有效成分，促进该虫产生聚集行为。

“Y”型嗅觉行为反应中10 μL/mL的α-红没药醇和α-蒎烯对雌、雄双斑长跗萤叶甲的引诱效果明显，α-红没药醇为该叶甲寄主植物挥发物和成虫粪便挥发物中所共有，α-蒎烯对松墨天牛和华山松大小蠹也都具有明显的引诱效果[32,34]。棕榈酸和α-石竹烯的引诱效果不明显，其中α-石竹烯对该虫有一定的趋避现象，但效果并不明显。在嗅觉行为反应中双斑长跗萤叶甲对α-石竹烯的反应并不明显，这与EAG的测定结果有一定的差别，这说明EAG反应只能在一定程度上反映出昆虫对该化合物是否具有一定的敏感性，但并不能确定具有EAG反应就同时具备嗅觉行为反应[38]。需要结合电生理反应和嗅觉行为反应才能有效筛选出该虫粪便挥发物中对其具有引诱趋性的活性化合物。

4 结 论

在双斑长跗萤叶甲成虫粪便中测得包括醇类、酯类、酮类、酸类等共29种挥发性化合物，其中以酯类化合物的种类和含量最多；通过该叶甲雌、雄成虫对选取的4种挥发性化合物的EAG反应，该叶甲雌、雄成虫均对α-石竹烯、α-蒎烯、α-红没药醇反应较明显。并且雌、雄成虫对于相同浓度的同种挥发物的反应，雌虫的敏感性普遍更高。其雌、雄成虫均对10 μL/mL的α-红没药醇EAG反应效果最明显，该叶甲雌、雄成虫对α-红没药醇的敏感性较高。且雌、雄双斑长跗萤叶甲对α-红没药醇的EAG反应值随挥发物浓度的增加而增大；该叶甲雌、雄成虫均对α-红没药醇和α-蒎烯有较为明显的趋性，对α-石竹烯和棕榈酸无选择性差异。α-红没药醇和α-蒎烯可能为该叶甲成虫粪便中的有效活性成分。