不同聚合度壳聚糖对奶山羊体外瘤胃发酵参数的影响

梁高沣,张 涛,李 永,孙小婷,李宗军,蔡传江,姚军虎,曹阳春

(西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100)

壳聚糖是由几丁质脱乙酰后获得的功能性多糖，一般用粘度来表示不同的分子量和聚合度。壳聚糖因具有很强的抗菌作用而在医药等方面具有广泛的应用前景[1-2]。壳聚糖对革兰氏阳性菌较为敏感，会抑制瘤胃中革兰氏阳性菌的数量，从而减少乙酸的生成[3-4]。反刍动物所需能量中，60%～70%是以挥发性脂肪酸(VFA)的形式供给[5]。相比乙酸和丁酸，丙酸作为唯一生糖型VFA，可提高能量效率、促进瘤胃发育、缓解酮病[6]。先前的体外[7-8]及体内[9-10]试验均表明，壳聚糖可调控瘤胃发酵促进丙酸产生。有体内试验表明，壳聚糖可提高奶牛的饲料效率[11]、丙酸浓度、氮利用效率和产奶量[10]，还可通过转移VFA改变瘤胃发酵模式，影响乙酸和丁酸的产生，降低甲烷产量，进而减少奶牛采食过程中的能量损失[8,12]。体外试验也证明了壳寡糖可增加丙酸浓度，降低乙丙比，进而提高能量利用效率及饲料转化率[13]。有研究表明，不同聚合度壳聚糖对同一种细菌有不同的敏感性，从而对瘤胃发酵产生不同结果[9-10,14]。因此，本试验旨在通过体外法探究不同聚合度的壳聚糖对奶山羊体外瘤胃发酵的影响，为壳聚糖应用于生产实践提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验设计

试验采用单因素试验设计，用带有8个800 mL发酵罐的人工瘤胃发酵系统(Sanshin, Tokyo, Japan)，共分为对照组、低聚合度(<200 mPa·s)、中聚合度(200～400 mPa·s)、高聚合度(>400 mPa·s)壳聚糖(Aladdin，中国上海)4个处理，每个处理4个重复，试验处理随机分配于发酵罐中。每个处理壳聚糖添加量为20 mg/g。共2期试验，每个试验周期为11 d，其中预试期为8 d，采样期为3 d。

1.2 奶山羊饲养及管理

从5头健康、无病、体重相似(55±1 kg)且安装永久性瘤胃瘘管的成年西农萨能奶山羊中收集瘤胃液。5只瘤胃瘘管奶山羊在采集瘤胃液之前未接触壳聚糖添加剂，饲养于西北农林科技大学畜牧试验基地，每只进行隔离单笼饲养。每天饲喂两次(8:00和17:00)，日粮精粗比为30:70，全天自由饮水。

1.3 人工唾液制备

(A液)：CaCl2·2H2O 13.2 g，FeCl3·6H2O 8.0 g，MnCl2·4H2O 10.0 g，CoCl2·6H2O 1.0 g，去离子水定容至100 mL。缓冲溶液(B液)：NH4HCO34.0 g，NaHCO335.0 g，去离子水定容至1 000 mL。常量元素溶液(C液)：Na2HPO45.7 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，KH2PO46.2 g，去离子水定容至1 000 mL。刃天青溶液：0.1%。还原剂溶液：1 mol/L NaOH 4.0 mL，Na2S·9H2O 0.625 g，去离子水定容至100 mL。

1.4 瘤胃液采集与处理

晨饲前，从瘘管中取出瘤胃内容物用4层尼龙纱布分离液体和固体部分。将5头羊的瘤胃液混合均匀，迅速转入经39 ℃预热并充满CO2的保温瓶，快速运回实验室。将70 g(湿重)固体接种物装进尼龙袋中(14 cm×7 cm，孔径50 μm)并紧密塑封。试验第1天，每个罐接种320 mL瘤胃液和320 mL人工唾液，之后在发酵罐中放入两个尼龙袋，其中一个装有日粮和不同聚合度壳聚糖(20 mg/g)，另一个装入瘤胃固体接种物。日粮为奶山羊所用饲料，在8～11 d换料后0、2、4、8、12、24 h采集12 mL发酵

表1 日粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the diet (DM basis)

注：每千克预混料含有: 石粉476.0 g， FeSO4·7H2O 25.38 g，CuSO4·5H2O 13.45 g，MnSO4·H2O 12.56 g，ZnSO4·7H2O 40.20 g，CoCl2·6H2O 83 mg，Na2SeO345 mg，KI 66 mg，VA 3×106IU，VD37.8×105IU，VE 3×103IU。营养水平为实际测定值。

Note: Vitamin-mineral premix (per kg): limestone 476.0 g， FeSO4·7H2O 25.38 g，CuSO4·5H2O 13.45 g，MnSO4·H2O 12.56 g，ZnSO4·7H2O 40.20 g，CoCl2·6H2O 83 mg，Na2SeO345 mg，KI 66 mg，VA 3×106IU，VD37.8×105IU，VE 3×103IU.Nutrient levels were measured values.

液用于VFA等指标的测定。挥发性脂肪酸测定采用气相色谱仪(Agilent 7820A GC)，方法参考Zhao等[15]。

1.5 数据分析

使用SPSS 20.0统计软件中一般线性分析中的单因素重复测量方差分析，用Duncan氏法进行多重比较。P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖对瘤胃发酵参数的影响

由表2可知，饲料中添加不同粘度的壳聚糖能够增加丙酸比例(P<0.05)，降低乙丙比(P<0.05)、丁酸(P<0.05)和异戊酸的比例(P<0.01)，且中、低聚合度壳聚糖作用效果优于高聚合度壳聚糖。壳聚糖对乙酸、异丁酸、戊酸、总挥发酸生成量无显著影响(P>0.05)。发酵液乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸比例及乙丙比均随着时间发生变化(P<0.05)，总酸生成量不受时间影响(P>0.05)。时间和处理之间不存在协同作用(P> 0.05)。

2.2 壳聚糖对不同时间点瘤胃发酵参数的变化

如图1A～C所示，随着时间的变化，发酵液中各组间乙酸、丙酸和乙丙比的变化趋势一致。乙酸比例从2 h到8 h呈增加趋势，并且在8 h达到最大值53.64 %。在每个时间点，不同处理组间乙酸比例无显著差异。丙酸比例从0～6 h缓慢下降，到6 h达到最低，之后缓慢上升。在任一时间点，中、低聚合度壳聚糖组丙酸比例均显著高于对照组(P<0.05)，而乙丙比显著低于对照组(P<0.05)。高聚合度壳聚糖也有显著增加丙酸比例、降低乙丙比的效果，但效果不如中、低聚合度壳聚糖。从图1D和图1G可知，中、低聚合度的壳聚糖均能显著降低丁酸和异戊酸比例(P<0.05)，且两组之间差异不显著。从图1E、1F和1H可知，壳聚糖对异丁酸、戊酸比例和总挥发酸浓度没有显著影响(P>0.05)。

注：同行肩标不同字母者差异显著(P<0.05)，C代表壳聚糖。下同。

Note: Different lowercase superscripts in the same row mean significant difference (P<0.05), C stands for chitosan, the same below.

3 讨 论

3.1 不同粘度壳聚糖对瘤胃发酵的影响

壳聚糖是一种天然绿色的生物聚合物，能够在自然界安全地降解[16]。在反刍动物中，VFA的浓度反映了瘤胃供能的能力[17]。葡萄糖在瘤胃中氧化为乙酸、丙酸和丁酸，分别为机体提供的能量为原来能量(2 805 kJ/mol)的 62%、109%和 78%，可见瘤胃进行丙酸型发酵时供能效率最高[13]。大量体内[9,18]和体外试验[19]已证实壳聚糖可促进丙酸合成，使瘤胃的发酵类型从乙酸型发酵向丙酸型发酵转变，降低瘤胃甲烷的排放，促进粗饲料的降解，从而提高饲料利用率，这也是目前饲料添加剂降低反刍动物甲烷排放的主要作用机理之一[20]。但目前研究壳聚糖对瘤胃发酵以及微生物影响的试验，结果存在一定差异，甚至相反。李宗军[13]的研究表明，壳聚糖可增强瘤胃丙酸发酵通路，降低乙丙比，减少甲烷的排放。Mingoti[21]发现在奶牛饲喂不同浓度的壳聚糖时，瘤胃中丙酸的浓度随壳聚糖浓度呈线性增加。李朝云[19]的试验表明，壳聚糖在低(20：80)、中精粗比(50：50)的日粮中，能够显著增加丙酸的含量；而在高精料(80：20)条件下，能够显著抑制乙酸生成，促进丁酸含量的增加。壳聚糖还可以改变瘤胃内菌群的结构[22]，提高微生物蛋白的合成，加速纤维的降解[23]，抑制革兰氏阳性菌的生长，进而减少乙酸的生成。而主要产物为丙酸的拟杆菌门和变形杆菌门都是革兰氏阴性菌[24]。Chung[14]则认为革兰氏阴性菌对壳聚糖的敏感性要高于革兰氏阳性菌。在体外试验中，水溶性壳聚糖能够有效抑制奶牛体内的大肠杆菌及沙门氏菌[12]。而Tokura[25]的研究则表明，不同聚合度的壳聚糖对大肠杆菌的敏感性并不一致，低聚合度壳聚糖表现为明显促进大肠杆菌的生长。有研究表明，壳聚糖携带的质子化铵，可以在弱酸性环境中被电离使其带正电荷，它可以与细菌细胞膜表面的负电荷接触，破坏细菌细胞膜的稳定性，并抑制细菌的生长[26]。各试验结果的不一致甚至相反可能是由于影响壳聚糖抗菌能力的因素较多，包括分子量、pH和金属离子等[27]。由于革兰氏阳性菌表面带负电荷，高分子量壳聚糖可形成带正电荷的絮凝，聚集于革兰氏阳性菌表面影响细菌对营养物质的吸收。分子量更低的壳聚糖进入菌体内部被酶解成为营养物质促进细菌生长。而pH越低，壳聚糖抗菌能力更强。若分子量过高，可能抑制了产丙酸的革兰氏阴性菌生长，造成丙酸产量的下降，进而造成甲烷排放的增加[28-29]。

本试验中不同聚合度的壳聚糖均可增加丙酸的产量，降低乙丙比，而中、低聚合度相对于高聚合度的壳聚糖的作用效果更加明显，这可能由于更低分子量的壳聚糖更多地进入产丙酸的革兰氏阴性菌菌体内部提供了更多的营养物质，从而促进其生长。较高分子量的壳聚糖进入革兰氏阴性菌菌体内部后与带负电荷的遗传物质相结合而起到抑菌作用效果可能增大，从而降低壳聚糖作为营养物质促进丙酸生成的效果，甚至可能总体上起到抑制丙酸生成的作用，这有待进一步试验探究。因此，实际生产中应考虑壳聚糖聚合度的影响。中、低粘度壳聚糖在经济效益上同样优于高粘度壳聚糖，生产中可优先选择中、低聚合度壳聚糖用于调控反刍动物瘤胃发酵。

3.2 壳聚糖对不同时间点瘤胃发酵参数的影响

从时间轴上看，壳聚糖对全时间段乙酸的生成无显著影响。这与张婕[30]结果一致。而Belanche[31]则在研究中发现，壳聚糖显著降低体外发酵液中乙酸的产量。出现不同的结果可能是因为本试验选择的三种聚合度壳聚糖都为低分子量壳聚糖，对细胞壁较薄的革兰氏阴性菌影响较大而对生成乙酸的革兰氏阳性菌的抗菌作用较小。各时间段中、低粘度壳聚糖组丙酸的比例均显著高于对照组，乙丙比均显著低于对照组，说明中、低聚合度壳聚糖进入瘤胃后全天内均能起到促进丙酸生成、降低乙丙比的作用，而作用效果所持续时间需进一步试验确定。

4 结 论

本试验结果表明，日粮中添加3种不同聚合度壳聚糖均能够显著地改变瘤胃发酵的模式，促进丙酸的生成，使瘤胃的发酵方式向更高能量利用率的方向进行。在调节瘤胃发酵效果和经济效益方面，中、低聚合度壳聚糖(聚合度<400 mPa·s)在调节瘤胃的发酵模式上有更显著的作用。