香蕉皮多酚对D-半乳糖致衰大鼠皮肤的改善作用

王昱

(陇南师范高等专科学校农林技术学院，陇南特色农业生物资源研究开发中心，甘肃 成县 742500)

皮肤是人体最大的器官，具有保护、感觉、调节体温、吸收、分泌与排泄、新陈代谢等生理功能.随着年龄增加，皮肤结构退变、功能衰退，临床表现为皮肤变薄、弹性减退、干燥粗糙、色素沉着、皱纹出现、血管突显等[1].然而皮肤衰老的具体机制仍不明确.越来越多研究表明，自由基损伤、免疫力功能减退、端粒酶活性下降、炎症反应等在皮肤衰老中具有关键作用[2-3].西医多采用外科手术提紧皮肤、注射肉毒素、皮下注射胶原等方法进行治疗，但存在风险性和副作用.研究表明，基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1,MMP-1)属于细胞外基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases,MMPs)，是分解皮肤胶原蛋白和降解细胞外基质的关键酶[4].水通道蛋白3(aquaporin3,AQP3)属于水-甘油通道亚家族，主要分布于皮肤表皮层中，是皮肤水转运过程中的关键蛋白[5-6].香蕉皮多酚(banana peels polyphenol)是香蕉皮的主要活性成分之一，具有抗真菌、抗癌、抗炎、抗氧化、抗氧化和降血脂等作用[7-8]，并在食品保鲜和化妆品等方面也有应用[9-12].本研究拟采用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)复制大鼠衰老模型，探讨香蕉皮多酚对D-gal致衰大鼠皮肤的保护作用及机制.

1 材料与方法

1.1 香蕉皮多酚提取制备

香蕉皮多酚由本实验室从香蕉皮中提取(98% HPLC)：参照文献[13]，称取100 g香蕉皮，切片，沸水中热烫3～5 min，用80%乙醇溶液、浸提温度80 ℃、时间为3 h、浸提2 次，合并滤液，离心，旋转蒸发回收乙醇，有机溶剂萃取分离纯化，冷冻干燥得到香蕉皮多酚提取物.

1.2 构建衰老大鼠模型与分组给药

健康SD大鼠30只(购于兰州大学实验动物中心，许可证编号：SCXK(甘)2005-0007，体质量200～250 g，雌雄各半)，同条件饲养一周后随机分为3组，每组10只，分为对照组、衰老模型组和香蕉皮多酚组.衰老模型组和香蕉皮多酚组大鼠颈背部皮下注射D-半乳糖(北京优尼康生物科技，批号MG05201)溶液(以体质量计)300 mg/kg[3]，同时香蕉皮多酚组灌胃(以体质量计)120 mg/kg的香蕉皮多酚[10]，对照组每天注射等量的0.9%生理盐水，1次/日，连续处理7周.

1.3 形态学和组织学观察

构建动物模型过程中每天观察各组大鼠精神状态、毛色、活动情况、饮食及饮水量等.于试验第 43天，每个试验组随机选5只大鼠，采用颈椎脱臼法处死大鼠，用 8%硫化钠溶液脱毛后立即取其背部正中皮肤(0.5 cm×0.5 cm大小)2块，去掉皮下脂肪及结缔组织，投入4%多聚甲醛液固定24 h，常规石蜡包埋切片(6 μm)，HE染色，在光学显微镜(Olympus，FX-35WA，Japan)下观察并拍照.

1.4 细胞凋亡及胶原蛋白含量的测定

每个试验组随机选5只大鼠，取其背部皮肤，去除皮下脂肪，分离表皮和真皮层，将真皮放入盛有无血清HBSS液(Hanks平衡盐缓冲溶液)的培养皿中冲洗，用眼科剪剪碎再用弯头吸管反复吹打，0.125%胰蛋白酶和 0.01%的EDTA在37℃水浴消化液30 min，终止消化后弃去消化液，收集细胞用吖啶橙/溴化乙啶(Sigma公司)荧光双染法(1∶1)染色，荧光显微镜(Olympas，IX71，Japan)计数分析细胞凋亡率，并按照ELISA检测试剂盒(ELx800，美国BioTek公司)说明书操作，检测Ⅰ型、Ⅱ型胶原蛋白的含量.

1.5 PCR检测皮肤组织MMP-1、AQP3 mRNA的表达

引物由上海涵悦生物科技有限公司设计，引物序列见表1.引物由生工生物工程(上海)技术有限公司合成.取大鼠皮肤，放入2 m L的离心管，加入1 m L Trizol后用匀浆器反复研磨，离心(12 000 r/min)15 min，取上清液通过酚-氯仿抽提RNA，将抽提的RNA 进行逆转录反应，实时荧光定量PCR扩增(RNA抽提试剂盒、反转录试剂、实时荧光定量PCR试剂购自Taka Ra公司).PCR按照试剂盒说明书进行操作(7900 HT Sequence Detection System定量PCR仪，美国ABI)，反应完毕采用 ABI 7500 软件分析，用公式 2-△△Ct方法进行相对定量.

表1 目的基因引物序列

1.6 Western-blot各组蛋白质表达

按照常规方法提取细胞总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度.定量后稀释好的样品经过SDS-PAGE凝胶电泳，转膜、封闭(5%脱脂奶粉，用TBST稀释).将膜取出，加单克隆兔抗鼠水通道蛋白3、基质金属蛋白酶-1(浓度均为1∶2 000)，4 ℃冰箱过夜，充分洗涤，加偶联辣根过氧化物酶(HRP)的二抗(浓度为1∶5 000)，室温下作用1 h，洗膜后加ECL发光液，以β-actin作为内参照，运用Image Lab 软件进行曝光成像，采用Quantity one 软件分析条带灰度值，试验重复3次.

1.7 数据处理

2 结果与分析

2.1 大鼠衰老动态情况观察

大鼠皮下连续注射D-gal，共7周，大鼠逐渐出现毛色晦暗，脱落，皮肤弹性差，嗜睡，精神萎靡，进食量明显减少，呈现明显衰老体征.而对照组和香蕉皮多酚组大鼠无明显相关体征.

2.2 香蕉皮多酚对大鼠皮肤组织结构的影响

对照组大鼠皮肤组织结构正常，表皮、真皮及皮下组织结构完整(图1-A).衰老模型组大鼠皮肤结构出现明显病理行变化，层次不清，表皮变薄，毛囊和皮脂腺数目严重减少，结缔组织增生明显(图1-B).与衰老模型组相比，香蕉皮多酚组大鼠皮肤组织结构相对完整，毛囊与皮脂腺数目增多.表皮和真皮组织增厚，真皮层的胶原纤维分布均匀，排列整齐(图1-C).

2.3 各试验组大鼠皮肤Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白的含量

与对照组相比，衰老模型组成纤维细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白含量显著降低(P<0.01).与衰老模型组相比，香蕉皮多酚组成纤维细胞Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白含量明显增多(P<0.05，P<0.01，图2).

2.4 各试验组大鼠皮肤的细胞凋亡

吖啶橙和溴化乙啶染料与DNA结合后在荧光下有不同的吸收值，亦可见细胞核中染色质浓缩的形态学特点，从而观察细胞的凋亡情况.在荧光显微镜下活细胞呈现均匀的绿色；早期凋亡细胞呈绿色，染色质凝聚或核裂解，细胞核中有鲜绿色的斑点；晚期凋亡细胞呈橙色，细胞核凝聚并常常裂解；坏死细胞呈橙色，无染色质凝聚.由图3可知，各实验组大鼠皮肤细胞均有不同程度的细胞死亡情况.与对照组相比，衰老模型组大鼠皮肤的细胞凋亡率显著升高(P<0.01)，对照组和香蕉皮多酚组大鼠皮肤的细胞凋亡率显著低于衰老模型组(P<0.01，表2).

A：对照组；B：衰老模型组；C：香蕉皮多酚组；D：真皮；E：表皮；H：皮下组织；标尺示50 μm.

与对照组比较 * P<0.05，** P<0.01；与衰老模型组比较 ▲P<0.01，▲▲ P<0.01.

表2 香蕉皮多酚对大鼠皮肤细胞凋亡率的影响

与对照组比较 *P<0.05，**P<0.01；与衰老模型组比较▲P<0.01，▲▲P<0.01.

*P<0.05，**P<0.01,vs.control group；▲P<0.01，▲▲P<0.01,vs.aging model group.

A：对照组；B：衰老模型组；C：香蕉皮多酚组，标尺示20 μm.

2.5 香蕉皮多酚对大鼠皮肤组织MMP-1和AQP-3表达的影响

MMP-1、AQP-3 和β-actin 的分子量分别为27，36，43 kb，条带清晰.以β-actin 的吸光度值作为内参照，对各组条带的吸光度值校正后进行半定量分析.与对照组相比，衰老模型组大鼠皮肤组织MMP-1蛋白含量极显著升高，而AQP-3蛋白含量极显著降低(P<0.01).经香蕉皮多酚干预后，大鼠皮肤组织MMP-1蛋白含量明显降低，而AQP3 蛋白含量明显升高(P<0.05，P<0.01).以上结果与PCR检测MMP-1和AQP-3 mRNA结果一致(表3，图4).

表3 香蕉皮多酚对大鼠皮肤组织MMP-1和AQP3 mRNA表达的影响

与对照组比较 *P<0.05，**P<0.01；与衰老模型组比较▲P<0.01，▲▲P<0.01.

*P<0.05，**P<0.01,vs.control group；▲P<0.01，▲▲P<0.01,vs.aging model group.

1：对照组；2：衰老模型组；3：香蕉皮多酚组；与对照组比较 * P<0.05，** P<0.01；与衰老模型组比较 ▲P<0.01，▲▲ P<0.01.

3 讨论

D-gal 是公认的致衰剂，广泛用于动物衰老模型和细胞体外衰老模型的复制，其构建衰老模型动物的各种生理、生化指标均与自然衰老相似[14-17].本研究采用D-gal 复制大鼠衰老模型，衰老模型组大鼠皮肤组织结构出现了明显的形态病理改变，皮肤组织结构不完整，层次不清，表皮变薄，附属器官减少，结缔组织增生，Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白含量明显减少，大量的细胞凋亡.已有研究报道，衰老的皮肤细胞出现核固缩、凋亡小体形成、粗面内质网肿胀、空泡形成等改变[18]，胶原纤维减少，皮肤在形态学上则表现为表皮变薄，表皮突和真皮乳头减少，真皮层胶原纤维排列紊乱，皮肤弹性降低[19]，这提示皮肤的衰老与胶原蛋白结构改变、数量减少及皮肤细胞凋亡有密切关系.本研究在复制大鼠衰老模型过程中灌胃香蕉皮多酚干预皮肤衰老进程，结果显示，皮肤组织结构相对完整，表皮增厚，真皮内胶原纤维增多，毛囊与皮脂腺数目增多，细胞凋亡率明显降低，这表明香蕉皮多酚能有效拮抗D-gal对大鼠皮肤的致衰作用.

现代衰老生物学理论认为，随年龄增加机体组织器官逐渐出现结构退变，而皮肤的衰老过程极其复杂，与遗传、免疫、自由基、细胞外基质、细胞因子等许多因素相关[1].本试验用实时荧光定量PCR检测大鼠皮肤组织MMP-1和AQP3mRNA基因的表达水平时，同时采用Western-blotting检测了大鼠皮肤组织MMP-1和AQP3蛋白的含量.正常皮肤组织中MMP-1蛋白的表达量极少，但在皮肤损伤、炎性浸润、创伤修复等情况下，MMP-1大量表达，从而破坏胶原纤维和弹性纤维的正常结构，皮肤胶原蛋白分解增多，皮肤变薄，导致皮肤出现皱缩细纹等衰老症状[20].本试验结果显示，衰老模型组大鼠皮肤中MMP-1基因表达显著升高，经香蕉皮多酚干预后，大鼠皮肤组织中MMP-1表达显著降低，提示香蕉皮多酚可通过下调MMP-1基因的表达来降低MMP-1蛋白的合成，延缓胶原降解、恢复纤维结构，从而发挥延缓皮肤衰老的作用.

AQP3可通过增加表皮水分和水合作用，提高皮肤甘油和尿素等溶质的通透性，从而减少水分的丢失，起到保湿作用[21-22].也可与中间丝相关蛋白协同完成皮肤的屏障修复[23].亦有研究表明，AQP3与皮肤自然衰老及光老化有密切关系，当皮肤缺失AQP3或暴露于紫外线时，会导致皮肤干燥和老化[24-25].因此，AQP3可作为抗衰老药物的作用靶点，在皮肤衰老过程中及延缓衰老治疗中有很重要的研究意义.本试验结果显示，衰老模型组大鼠皮肤中AQP3基因表达显著降低，经香蕉皮多酚作用后，大鼠皮肤组织中AQP3表达显著上调，提示香蕉皮多酚可通过增加AQP3的表达量，使皮肤细胞的水合能力、甘油的转运能力增加，从而改善皮肤表面粗糙等衰老表现，起到抗皮肤衰老的作用.

4 结论

综上所述，香蕉皮多酚对衰老大鼠皮肤组织的损伤有明显的保护作用，这种作用可能与增加胶原蛋白含量、抑制皮肤细胞凋亡、调节MMP-1和AQP3基因的表达有关.香蕉皮多酚作为一种天然产物，可开发用于美容治疗及美容保健的功能性食品.