舒血宁注射液中蛋白质的含量测定研究

李玉彩，李响明*，王文鹏，孙胜斌

(1.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430；2.中药注射剂新药技术开发国家地方联合工程实验室，河北 石家庄 051430)

中药注射剂作为传统中药的创新剂型，具有高生物利用度、作用迅速的特点，在治疗急重症方面具有很大的优势。随着临床的广泛使用，不良反应与安全性等问题随之引起了人们的关注[1-2]，蛋白质等大分子物质可能是引起其不良反应的重要影响因素之一。

由银杏叶提取物制得的注射液，主要含有总黄酮类和内酯类化合物[3]。银杏叶提取物具有扩张血管、改善微循环的作用，在临床上应用广泛[4-5]。一般来说，在中药注射液生产中已经去除了绝大多数的蛋白类物质，除另有规定外，依照中国药典，制剂的蛋白质定性检查应符合要求[6]。舒血宁注射液在生产中应用醇沉、水沉、柱层析等精制工艺可去除大部分杂质，制剂按中国药典方法检查蛋白质应该符合规定，不过关于舒血宁注射液制剂中残留蛋白质定量测定的方法鲜有报道。

目前常用的检测蛋白质的方法有磺基水杨酸法、福林酚(Lowry)法、凯氏定氮法、体积排阻色谱(SEC)法、考马斯亮蓝法等[7]。磺基水杨酸法[6]是自2000年版《中国药典》以来沿用至今的定性检查，以是否出现浑浊作为合格的依据，此方法操作简单，但灵敏度不高，偶尔出现假阳性结果[8-9]。福林酚(Lowry)法易受还原物质、酚类、枸橼酸、硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等的干扰。凯氏定氮法可最终测出含氮量，但含氮量与蛋白质的换算需要系数，测定结果受产品中氨基酸的影响，且方法操作过程较为繁琐、费时，在测定过程中还会有大量有毒有害气体产生，危害环境与健康。考马斯亮蓝法在检测时受干扰较少，此方法利用溶液颜色的差异进行比色测定，适用于蛋白类的定量分析，并且检测的重复性好、精密度高、线性关系好，尤其适用于蛋白质的微量分析[10-14]。

1 材料

1.1 仪器与试剂

TU-1950紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；CPA225D电子天平(德国赛多利斯)；考马斯亮蓝G250(分析纯)；乙醇(分析纯)；磷酸(分析纯)。

1.2 样品与对照品

舒血宁注射液为市售产品，分别标称为A、B、C三个厂家。对照品血清白蛋白(牛)(批号140619-201723，购于中国食品药品检定研究院)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取血清白蛋白(牛)，加水溶解定容至量瓶中，配制成1 mg/mL的牛血清白蛋白溶液。精密量取5 mL溶液置50 mL量瓶中，加水定容至刻度摇匀，即得对照品溶液。

2.2 波长的选择

取对照溶液加酸性染色剂混匀后在400～800 nm范围内全波长扫描，结果显示在596.2 nm波长处有最大吸收。供试品溶液同法测定，在595 nm处有吸收度值。因此测定波长选择在595 nm处。见图1。

图1 对照品溶液400～800 nm波长范围内扫描结果

2.3 线性范围考察

分别精密量取对照品溶液0、1.0、2.0、4.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置10 mL量瓶中，加水定容至刻度摇匀。分别精密量取1 mL置具塞试管中，加5 mL酸性染色液，混匀，立即在595 nm处测定吸光度，同时以0号管作为空白。以吸光度值为纵坐标，以牛血清白蛋白浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果表明，牛血清白蛋白在范围内线性关系良好，见表1。

表1 线性范围

2.4 精密度试验

取本品按前述方法连续测定6次，计算6次的吸光度值RSD。结果RSD为0.53%，表明系统精密度良好。

2.5 溶液稳定性试验

取本品按前述方法，混匀后分别放置0、2、4、6、8、10 min后测定，计算6次吸光度值的RSD为0.98%，说明样品与酸性染色液混匀后在室温放置10 min内稳定性良好。

2.6 回收率试验

量取舒血宁注射液各0.5 mL，分别加入对照品，摇匀后制成低、中、高三个浓度的供试品溶液，按前述方法同法操作，计算回收率。结果显示，回收率为96.97～100.0%，RSD<2%，表明所用方法准确性好。见表2。

表2 加样回收率试验结果

2.7 重复性试验

取本品按前述方法平行处理6份，分别测定吸光度，RSD为0.42%，表明系统的重复性良好。

2.8 样品测定

取9批舒血宁注射液，精密吸取14 mL，按标准曲线制备方法，自“加入5 mL酸性染色液”起，依法测定吸光度。从标准曲线上读出本品中蛋白质的含量，计算，即得。结果见表3。

表3 样品中蛋白质的测定结果

3 讨论

本研究共检测了3个厂家共9批含银杏叶提取物的注射液成品，结果显示蛋白质的含量均在0.1 mg/mL左右，含量较低，与使用中国药典2015年版中磺基水杨酸法定性检查结果一致，均为澄清，未出现浑浊。蛋白质水平偏低，可能与药用部位为叶，用稀乙醇提取、又经过柱层析等精制工艺处理有关[15]。因此，舒血宁注射液产品中残留微量的蛋白质。而3个厂家的产品中蛋白质含量仍有一定差别，应该与产品的投料方式[4]、精制工艺有关。为了更好地保障临床用药安全，降低不良反应发生率，生产企业要持续优化工艺，不断提升产品质量水平，结合国家规定的注射液产品中蛋白质的含量限度进行生产。

本研究建立了一种简单、可靠，可用于检测舒血宁注射液中蛋白质含量的方法。此方法灵敏度高，对设备要求较低，结果准确，对提升产品质量具有重要的参考意义，对其他注射液中蛋白质类杂质的限量检查亦有借鉴作用。