光化学衍生-高效液相色谱法测定蛴螬中黄曲霉毒素含量

赵 磊，刘仕聪，刘云菲，李正刚，王路宏，孙艳涛*

(1.四平市食品药品检验所，吉林 四平 136000；2.吉林师范大学 化学学院，吉林 四平 136000)

蛴螬为金龟子科昆虫朝鲜黑金龟子HolotrichiadiomphaliaBates的干燥幼虫[1]。蛴螬收载于《中国药典》2015年版四部成方制剂中“本版药典未收载的药材和饮片”项下，《中国药典》2015年版一部中收载的大黄虫丸、大黄虫胶囊、大黄虫片处方中均用到蛴螬[2-3]。民族药中朝鲜族的习用药材，朝药图志收载的功能主治为“破血，利水消肿”，常用于太阴人跌打损伤、羸瘦腹满、癥瘕、经闭、浮肿等病症[4]。

近年来，中药中真菌毒素安全性已是中药行业十分关注的问题之一[5-7]。《中国药典》2015版药典收载多个中药材及饮片的黄曲霉毒素测定项目。黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素破坏人及动物肝脏组织，严重时，可导致肝癌甚至死亡。在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性和致癌性也最强[8-10]。

目前，检测蛴螬中黄曲霉毒素的方法暂无文献报道。本研究通过采用光化学衍生-高效液相色谱法测定10批蛴螬药材中黄曲霉毒素的含量[11-13]，检测出1批次药材中含有黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B2成分。测定结果说明，蛴螬药材的加工处理过程及贮存条件应引起足够重视。

1 仪器与试药

1.1 仪器

安捷伦1260型高效液相色谱仪，配有荧光检测器(安捷伦科技有限公司)；2001B型系列超纯水器(北京普析通用仪器有限责任公司)；电子天平BT125D型万分之一分析天平(上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂制造)；光化学衍生器(254 nm)(普瑞邦科技有限公司)。

1.2 试药

黄曲霉毒素混合对照品，来源：中国食品药品检定研究院，批号；610001-201804，浓度(AFB10.93 μg·mL-1、AFB20.30 μg·mL-1、AFG10.93 μg·mL-1、AFG20.35 μg·mL-1)；蛴螬(收集十批药材，规定编号为qc1-qc10经鉴定均为正品蛴螬)。甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

精密移取黄曲霉毒素混合对照品0.5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为贮备溶液。精密量取贮备溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得黄曲霉毒素混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液制备

取供试品粉末约15 g(过二号筛)，精密称定，置于均质瓶中，加入氯化钠3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，高速搅拌1 min，离心5 min，精密移取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，量取续滤液20.0 mL，通过免疫亲合柱，流速3 mL·min-1，用水20 mL洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2 mL量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。光化学衍生器(254 nm)，以荧光检测器检测，激发波长λex=365 nm，发射波长λex=450 nm。

2.3 测定方法

精密吸取上述供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的量，计算，即得。

2.4 色谱条件

以甲醇-乙腈-水(40∶18∶42)为流动相；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃。

采用柱后衍生法检测：光化学衍生法：光化学衍生器(254 nm)，以荧光检测器检测，激发波长λex=360 nm，发射波长λex=450 nm。混合对照品、加标供试品色谱，见图1。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性考察 精密移取黄曲霉毒素混合对照品0.5 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为贮备溶液。精密移取该贮备溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得黄曲霉毒素混合对照品溶液。

分别精密吸取上述混合对照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。见表1。

A.黄曲霉标准品；B.蛴螬加混合黄曲霉标样：1.黄曲霉毒素G2、2.黄曲霉毒素G1、3.黄曲霉毒素B2、4.黄曲霉毒素B1

图1 黄曲霉高效液相色谱图

表1 黄曲霉混合标准品标准曲线

2.5.2 精密度试验 取黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2混合对照品溶液，浓度为37.2、12、37.2、14 ng·mL-1，精密吸取对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，测定，即得。测定结果以峰面积计算RSD均小于2%，结果表明仪器精密度良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，加入混合标准溶液使浓度分别为37.2、12、37.2、14 ng·mL-1。按照色谱条件测定，分别于配制后0、3、6、9、12、15 h，精密吸取20 μL，注入液相色谱仪，记录峰面积，测定结果以峰面积计算RSD均小于2%，结果表明供试品溶液在15 h内稳定，证明该方法稳定性良好。

2.5.4 回收率试验 取qc1供试品粉末约15 g(过二号筛)6份，精密称定，分别置于均质瓶中，精密加入黄曲霉毒素混合对照品50 μL，按“3.2”项依法操作，精密吸取上述供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，从标准曲线上读出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的量，计算回收率。见表2-表5。

表2 黄曲霉毒素B1回收率

表3 黄曲霉毒素B2回收率

序号试样取样量(g)样中黄曲霉毒素G1含量(ng)黄曲霉毒素G1加入量(ng)实测量(ng)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)115.0101046.5047.78102.75215.0103046.5057.92124.56315.0036046.5045.3397.48415.0021046.5045.6098.06103.3110.6515.0048046.5043.8894.37615.0012046.5047.72102.62

表5 黄曲霉毒素G2回收率

2.6 样品含量测定

按“2.4”项下色谱条件测定10批供试品溶液，进样量20 μL。结果蛴螬中有1批检出了含有黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B2成分，其余9批均未检出黄曲霉毒素。见表6。

表6 样品含量测定

3 讨论

近年来中药中真菌毒素安全性已是中药行业十分关注的问题之一。中国药典2015版药典收载多个中药材及饮片的黄曲霉毒素测定项目，并规定了具体限值：每1 000 g含黄曲霉毒素B1不得过5 μg，含黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2和黄曲霉毒素B1总量不得超过10 μg。由于蛴螬属于昆虫类药材，采用烫死后干燥处理，在干燥过程中，处理不当极易被有害真菌污染。因此，对蛴螬进行黄曲霉毒素的考察十分必要。在采用样品检测方法中，比较碘衍生化方法与光化学衍生方法，发现光化学衍生方法优于碘衍生化方法，光化学衍生化具有操作简便、灵敏度高的特点。

本实验研究在蛴螬样本中检测出1批次含有黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B2成分。测定结果表明，在蛴螬药材加工处理及贮存条件方面应引起重视。