梨果不同部位中熊果苷的差异分布规律

李 凡，罗嘉亮，李六林，郝瑞杰

（山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801）

梨属于蔷薇科Rosaceae 梨属Pyrus植物，在世界各地栽培广泛，中国是东方梨的重要原产地之一，种质资源十分丰富[1]。梨果实肉脆多汁，富含糖类、有机酸、维生素等营养物质和酚类物质[2]。植物中的酚类物质，不仅在植物的生长发育过程中涉及许多生理代谢反应[3]，还会直接影响果实的营养品质[4]和植株的整体抗性[5-6]。袁江等[7]研究发现，酚类物质在不同梨品种间的含量存在很大差 异；Li 等[8]对我国8 个梨品种的酚类物质进行了分析，结果发现，梨果中主要的酚类物质是熊果苷；Li 等[9]对10 个品种梨的酚类物质进行测定后发现，其果皮与果肉中均存在熊果苷。

熊果苷是当今流行的最为安全的美白原料，它能抑制体内酪氨酸酶的活性，阻断多巴及多巴醌的合成，进而阻止黑色素的形成[10]。李静等[11]证实了熊果苷是对苯二酚衍生物。梨果具有镇咳、祛痰、平喘等功用[12-13]，王亚芳等[14]对小鼠饲喂熊果苷的试验结果证实了梨果中具备上述功用的主要物质是熊果苷。熊果苷是植物体中重要的次生代谢产物，广泛存在于多种植物的果实[15]、花[16]、茎皮[17]、种子[18]等部位中。但是，目前国内外对梨果中熊果苷的研究尚处于起步阶段[19-20]，关于梨果中熊果苷等酚类物质的时空分布规律等方面的研究还未深入。为此，本研究以产自山西省太谷县的栽培梨品种为材料，利用高效液相色谱法，对不同品种梨果不同部位中熊果苷的含量进行了测定和分析，以期深入了解熊果苷含量在多个梨品种中的分布差异情况，并阐明熊果苷在梨果中的分布规律，从而为熊果苷的开发利用提供参考依据，并为后期梨果中熊果苷代谢机理的研究及育种实践提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018年9月在山西省农业科学院果树研究所梨种质资源圃采集常规管理的成熟期梨果 实，供试的5 个梨品种分别为‘玉露香’‘库尔勒’‘黄冠’‘丰水’‘鸭梨’，每个品种各选3 株长势良好的树体，在树冠外围各采收3 个果实形状和品质均良好的梨果。本试验后续处理及测试均在山西农业大学园艺学院进行，每处理各设3 个重复。

1.2 试验药品及仪器

试验药品：甲醇、乙腈、甲酸、熊果苷标准品均为色谱纯，其纯度均≥99%，均购自北京索莱宝公司；浓磷酸为分析纯；试验用水为超纯水。

试验仪器：U3000 高效液相色谱仪（Thermo LTQ XL），配备四元流动相泵、二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器（FAD）、自动进样器、Venusil ASB C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱（Agela technologies）；3K30 离心机（Sigma）；Orion Star A 211 pH 测量仪（Thermo Scientific）；超声波清洗仪；电子天平；漩涡振荡仪。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的制备

取熊果苷标准品20 mg，加入1 mL 的色谱级甲醇，配制成20 mg·mL-1的母液。将母液稀释制备成浓度依次为1 000、500、100、50、30、 10 μg·mL-1的单一标准品溶液（下称“单标”），各吸取1 mL 存入棕色进样瓶中，按照色谱条件依次进样，不使用时将其保存于-20 ℃的温度条件下。

1.3.2 果实部位及果肉切片部位的选取

参照曹玉芬[21]的方法，分别选取果皮、果肉、果心、果肩（果梗基部）、果顶（萼洼部位）等部位。

果肉切片部位的选取：取去皮去核后的果肉，以果核为中心轴线，围绕其旋转1 周，依据梨果膨大程度，按其厚度将果肉均匀划分为5 个部分，由果皮至果心的横向方向依次划为部位I、部位II、部位III、部位IV 和部位V。梨果肉不同部位的俯视示意图如图1 所示。

1.3.3 熊果苷的提取

参照曾少敏等[22]提取酚类物质的方法（稍作改进）提取熊果苷。分别将梨果各部位以液氮研磨成粉末后，各精确称取0.6 g置于10 mL的离心管中，于-40 ℃的温度条件下保存。液相色谱上样前，在10 mL 的离心管中加入色谱纯的纯甲醇4.8 mL、超纯水1.2 mL，漩涡振荡充分混匀，常温超声15 min后静置，以5 000 r·min-1的转速于4 ℃的温度条件下离心20 min，取上清液过0.22 μm 的有机相滤膜，取1 mL 过滤液存入棕色进样瓶中以待测。

图1 梨果果肉不同切片部位的俯视示意图Fig.1 Overlooking diagram of different parts in pear fruit

1.3.4 高效液相色谱条件的设定

参照孔祥虹等[23]的方法（稍作改进）设定高效液相色谱条件。流动相分别为乙腈（A）和0.5%的甲酸水（B），其梯度洗脱程序见表1。自动进样器流速设为0.8 mL·min-1；柱温控制为30 ℃；测定波长为280 nm，波长精度为（±0.1）nm；进样量为20 μL，程序运行时间为69 min。

1.4 数据处理及分析

分别利用SAS 8.1 和Microsoft Excel 2013 软件对数据进行处理分析和作图。

表1 流动相梯度洗脱程序（VA∶VB）Table 1 Gradient elution procedure with mobile phases (VA∶VB)

2 结果与分析

2.1 熊果苷标准曲线的建立

将配制好的浓度梯度分别为10、30、50、100、500、1 000 μg·mL-1的单标按照已经确立的色谱条件分别进样，根据色谱图的结果选择熊果苷标准物质含量的峰面积进行线性回归分析，强制过原点后得到的熊果苷含量（μg·mL-1）与峰面积的线性方程（y=0.073 7x，R²=0.992 4）如图2所示。熊果苷的出峰时间是5.823 min，如图3 所示。样品中熊果苷的含量以外标法定量，将测定结果换算后以每克鲜样所含熊果苷的微克数表示，单位为μg·g-1。

图2 熊果苷的标准曲线图Fig.2 Standard curve of arbutin

2.2 不同品种梨果果皮、果肉、果心中熊果苷的含量分析

对供试的5 个梨品种成熟期果实果皮、果肉、果心中熊果苷的含量进行了高效液相色谱分析，结果如图4 所示。各品种梨果果皮中熊果苷的含量为171.51 ～872.23 μg·g-1，‘玉 露香’‘库尔勒’‘黄冠’‘丰水’‘鸭梨’果皮中熊果苷的含量分别为872.23、416.19、171.51、289.51、364.45 μg·g-1；各品种间果皮中熊果苷的含量存在差异，‘玉露香’果皮中熊果苷的含量较高，与其它品种间的差异显著。各品种梨果果肉中熊果苷的含量为2.17 ～12.94 μg·g-1，‘玉露香’‘库尔勒’‘黄冠’‘丰水’‘鸭梨’果肉中熊果苷的含量分别为7.69、2.17、9.18、10.31、 12.94 μg·g-1；各品种间果肉中熊果苷的含量存在差异，‘库尔勒’果肉中熊果苷的含量较低，‘库尔勒’与‘玉露香’‘黄冠’间其含量差异均不显著，而与‘丰水’‘鸭梨’间其含量差异均显著；但‘玉露香’和‘黄冠’之间无差异，‘丰水’和‘鸭梨’之间也无差异。各品种梨果果心中熊果苷的含量为74.45 ～268.20 μg·g-1，‘玉露香’‘库尔勒’‘黄冠’‘丰水’‘鸭梨’果心中熊果苷的含量分别为150.93、74.45、130.44、117.87、268.20 μg·g-1；其中，‘鸭梨’果心中熊果苷的含量较高，与其它品种间的含量差异显著；除‘鸭梨’外，其余品种间的含量无显著性差异。由图4 可知，对同一品种进行横向比较，果皮、果肉、果心中熊果苷的含量存在显著性差异，果皮中熊果苷的含量最高，果心次之，果肉中熊果苷的含量最低。果皮与果肉中熊果苷的含量相差较大；在供试的 5 个品种中，‘库尔勒’果皮与果肉中熊果苷的含量差值最大，其果皮中熊果苷的含量是其果肉中的191.79 倍；而‘黄冠’果皮与果肉中熊果苷的含量差值较小，其果皮中熊果苷的含量是其果肉中的18.68 倍；各品种果皮中熊果苷的含量是其果心中的1.31 ～5.78 倍，‘玉露香’的含量倍数最高，而‘黄冠’的含量倍数最低。

图3 熊果苷的色谱图Fig.3 Chromatogram map of arbutin

图4 不同品种梨果果皮、果肉、果心中熊果苷的含量比较Fig.4 Comparison of arbutin contents in peel, pulp and core of different cultivars of pear fruits

2.3 不同品种梨果果肩和果顶中熊果苷的含量分析

对供试的5 个梨品种成熟期果实果肩和果顶中熊果苷的含量进行了高效液相色谱分析，结果如图5 所示。5 个品种梨果果肩中熊果苷的含量为34.96 ～169.74 μg·g-1，‘玉露香’‘库尔勒’‘黄冠’‘丰水’‘鸭梨’果肩中熊果苷的含量分别为169.74、65.67、34.96、137.40、77.25 μg·g-1； 5 个品种梨果果顶中熊果苷的含量为35.41 ～ 123.34 μg·g-1，‘玉露香’‘库尔勒’‘黄冠’‘丰 水’‘鸭梨’果顶中熊果苷的含量分别为123.34、73.04、35.41、42.97、94.21 μg·g-1。纵向比较同一品种梨果果肩和果顶中的熊果苷含量后发现，‘玉露香’和‘丰水’果肩中熊果苷的含量均高于其果顶中的含量，其中，‘玉露香’果肩中的熊果苷含量是其果顶中的1.38 倍，‘丰水’果肩中的熊果苷含量是其果顶中的3.20 倍；而‘库尔勒’‘黄冠’和‘鸭梨’果肩中的熊果苷含量均低于其果顶中的含量，其果顶中的熊果苷含量分别是其果肩中的1.11、1.01、1.22 倍。显著性差异分析结果表明，‘丰水’果肩和果顶两个部位间其熊果苷含量存在差异，除‘丰水’外其余各品种间果肩和果顶中的熊果苷含量均无显著性差异。

图5 不同品种梨果果肩和果顶中熊果苷的含量比较Fig.5 Comparison of arbutin contents in shoulder and top parts of different cultivars of pear fruits

2.4 梨果果肉不同切片部位中熊果苷的含量分析

将供试的5 个品种成熟期梨果果肉分别切分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ5 个部位后对其进行高效液相色谱分析，结果如图6 所示。‘玉露香’果肉的 5 个切片部位的熊果苷含量为3.44 ～17.96 μg·g-1， 其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部位的熊果苷含量分别为17.96、3.44、4.43、17.59、9.54 μg·g-1；各个切片部位间无显著性差异。‘库尔勒’果肉的5 个切片部位的熊果苷含量 为34.92 ～105.65 μg·g-1，其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部位的熊果苷含量分别为105.65、58.57、34.92、42.02、67.30 μg·g-1；除Ⅰ与Ⅲ、Ⅳ部位间均有显著性差异外，其余各个切片部位间无显著性差异。‘黄冠’果肉的5 个切片部位的熊果苷含量为16.28 ～46.36 μg·g-1，其 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部位的熊果苷含量分别为46.36、16.28、20.44、22.39、42.33 μg·g-1；除Ⅰ和 Ⅴ、Ⅱ部位间均有显著性差异外，其余各个切片部位间无显著性差异。‘丰水’果肉的5 个切片部位的熊果苷含量为32.79 ～73.81 μg·g-1，其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部位的熊果苷含量分别67.80、32.79、73.81、34.92、37.99 μg·g-1；Ⅲ与Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ部位之间及部位Ⅰ与Ⅱ、Ⅳ部位之间均有显著性差异，其余各个切片部位间无显著性差异。‘鸭梨’果肉的5 个切片部位的熊果苷含量为37.04 ～ 105.47 μg·g-1，其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部位的熊果苷含量分别为105.47、73.27、37.04、55.54、53.46 μg·g-1；部位Ⅰ与其余4 个切片部位之间及部位Ⅱ与Ⅲ之间均有显著性差异，而其余各个切片部位间无显著性差异。熊果苷在梨果肉内广泛存在，从其各个切片部位中均可检测到，供试的 5 个梨品种中，‘玉露香’果肉5 个切片部位的熊果苷含量之间无显著性差异，除‘玉露香’外的其余4 个品种5 个切片部位间其含量均存在差异，但是，各品种梨果果肉中熊果苷含量较高的切片部位均为部位Ⅰ。

图6 不同品种梨果果肉不同切片部位的熊果苷含量比较Fig.6 Comparison of arbutin contents in different positions of pear pulp sections from different cultivars

3 结论与讨论

最近几年有关熊果苷的研究日益被关注，因为熊果苷具有镇咳、美白等功效[24]，是梨果实中含量较高的酚类物质[19]。马良[25]对不同梨品种进行研究后指出，白梨果实中酚类物质含量最高的是熊果苷；韩凯[26]对四大系统不同梨品种的熊果苷进行测定后指出，白梨果实中熊果苷含量普遍较高，而白梨系统不同品种间梨果实中的熊果苷含量具有显著性差异；曾少敏等[27]对不同梨品种的熊果苷进行测定后发现，白梨系统果皮中熊果苷的平均含量显著高于其它系统。本研究结果表明，供试的5 个梨品种间其熊果苷含量也存在显著性差异，属于白梨系统的‘玉露香’‘库尔勒’[28]和‘鸭梨’果皮中的熊果苷含量均显著高于属于砂梨系统的‘丰水’果皮中的含量，这与马良、曾少敏和韩凯的研究结果均一致。白梨系统的品种是北方主栽梨品种，研究白梨系统对我国梨树栽培具有重大经济意义[29]。

张小双等[30]对梨果不同部位中的熊果苷进行检测后发现，其含量差异显著；李浩男等[31]在对梨成熟期果皮的研究中发现，梨果皮中主要的酚类化合物是熊果苷；Escarpa 等[15]将5 个西洋梨分为果皮和果肉两个部位进行研究，结果发现，两个部位中的熊果苷含量，果皮显著高于果肉；李丽梅等[32]对北方主栽梨品种进行测定后指出，3 个部位中的熊果苷含量，果皮高于果肉和果心。本研究将梨果分为果皮、果肉、果心、果肩、果顶5 个部位进行研究，结果表明，果皮是熊果苷含量最高的部位，这与张小双、Escarpa 和李丽梅的研究结果均一致。研究中还发现，果皮中熊果苷含量高的梨品种，其果肉和果心中熊果苷的含量相对较低，如‘玉露香’和‘库尔勒’；而果皮中熊果苷含量低的梨品种，其果肉和果心中熊果苷的含量则相对较高，如‘黄冠’和‘鸭梨’。郭静等[33]研究指出，熊果苷易溶于水，由此推测，出现此类结果的原因可能与熊果苷的运输有关，熊果苷在梨树体内合成后，因其溶解性可能会造成随着水分的运输而表现出分布不均匀的现象。供试的果肉、果肩、果顶同为去皮去核的梨果肉，比较同一品种这3 个部位中的熊果苷含量可发现，果肉较果肩和果顶低，结合熊果苷含量最高的部位是梨果皮这一结果可以推测，由于梨果皮存在的蒸发现象[34]，所以存在于梨果实内的熊果苷，更有可能向梨果外缘富集，因此，同在外缘区域的果肩、果顶也有可能都会出现熊果苷含量较高的现象。

对供试的5 个梨品种果肉的5 个切片部位进行了高效液相色谱分析，研究了熊果苷在梨果肉中的分布规律。结果表明，‘玉露香’梨果果肉 5 个切片部位间其熊果苷含量无显著性差异，即熊果苷在‘玉露香’梨果肉中的分布均匀。不同于果皮与果心的是，梨果肉属于结构相似的薄壁组织[35]，梨果在膨大期通过快速吸水以实现体积重量的增大[36]，这种结构相似的均一性与熊果苷在梨果肉内分布均匀之间存在着直接的关系，但是，目前梨果内熊果苷的生物合成仍未得到阐明。除‘玉露香’外，其余4 个梨品种熊果苷含量较高的切片部位均为部位Ⅰ，因为部位Ⅰ靠近果皮，可能受到了果皮中熊果苷含量高的影响。

熊果苷广泛存在于梨果内，供试的5 个梨品种均富含熊果苷这一酚类物质，且各品种间其含量存在差异，‘玉露香’梨果中的熊果苷含量最高；同一品种各部位间其含量也存在差异：横向比较可知，果皮中的熊果苷含量最高，果心次之，果肉最低；纵向比较可知，果肩和果顶中的熊果苷含量相近。对梨果肉的切片分析结果表明：‘玉露香’梨果肉5 个切片部位间其熊果苷含量无明显差异，说明熊果苷在其果肉中的分布均匀且不同切片部位间其含量相差较小；除‘玉露香’外的其余梨品种，熊果苷含量最高的切片部位均为靠近果皮的位置。总之，熊果苷的多种功效及其在植物中的广泛存在值得在生产中加以开发和利用。本研究阐明了成熟期梨果不同部位中熊果苷的差异分布规律，后续研究将进一步探寻不同生育期梨果内熊果苷含量的节律变化特点，并结合梨果实发育转录组学，揭示熊果苷的生物合成及富集机理。